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正向和反向引物浓缩原液（10 μM工作原液：GOI)。 •    可以在sigmaaldrich.com/oligos上订购定制寡核苷酸。 热启动预混液 (Taq，Buffer，dNTPs，参考燃料，MgCl2) KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™， [货号KCQS00](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/KCQS00)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox， [货号 KCQS01](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/KCQS01)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 带ROX， [货号 KCQS02](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/KCQS02)KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ 用于iQ， [货号 KCQS03](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/KCQS03) __兼容仪器：____兼容仪器：____兼容仪器：____兼容仪器：__ Bio-Rad CFX384™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 5700Bio-Rad iCycler iQ™ Bio-Rad CFX96™Applied Biosystems 7500Applied Biosystems 7000Bio-Rad iQ™5 Bio-Rad MiniOpticon™Fast Applied Biosystems ViiA 7Applied Biosystems 7300Bio-Rad MyiQ™ Bio-Rad MyiQ™Stratagene Mx3000P®Applied Biosystems 7700  Bio-Rad/MJ Chromo4™Stratagene Mx3005P™Applied Biosystems 7900  Bio-Rad/MJ Opticon 2Stratagene Mx4000™Applied Biosystems 7900 HT Fast  Bio-Rad/MJ Opticon® Applied Biosystems 7900HT  Cepheid SmartCycler® Applied Biosystems StepOnePlus™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex Applied Biosystems StepOne™  Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s    Illumina Eco qPCR    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000    Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q    Roche LightCycler® 480    表 P17-42.SYBR Green PCR 混合选择指南 ## 耗材 - 无菌过滤器[移液管吸头](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/products/labware/liquid-handling-and-dispensing/pipette-tips) - [无菌 1.5 mL 螺旋盖微量离心管 (CLS430909)](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/CLS430909) - PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式： •    单个独立的薄壁200μL PCR管（[Z374873](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/Z374873)或[P3114](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/P3114)） •    孔板       - [96孔板（Z374903）](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/Z374903)       - [384孔板（Z374911）](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/Z374911) •    孔板密封       - [ThermalSeal RTS™ 封膜 (Z734438)](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/Z734438)       - [ThermalSeal RT2RR™ 封膜  (Z722553)](https://www.sigmaaldrich.com/SG/zh/product/sigma/Z722553) ### 本方案注意事项 - 使用随机引发或oligo-dT引发方法产生cDNA，并以1:10稀释备用，但也可以使用任何合适的替代模板。 - 所有反应均一式两份作为技术重复。 - 如果使用PCR板，请按照板示意图（例如__图P14-19__所示）进行，以确保反应混合物样品 和对照被添加到正确的孔中。   ## 方法 1.    根据__表P14-35__制备56个反应的预混合物。混合均匀，避免气泡。 试剂每次 单次20 μL反应的体积 (μL)56份 反应物的体积 (μL) KiCqStart SYBR® Green qPCR ReadyMix 2×10560 正向引物 (10 μM)0.950.4 反向引物 (10 μM)0.950.4 PCR级纯水4.2235.2 表 P14-35.用于Ta优化的反应预混合物。 2.    将步骤1中的448 μL预混合物（即一半）移入单独的管中，以设置无模板对照（NTC） 反应。 3.    将112 μL模板添加到步骤2中剩余的预混合物中。将模板预混合物置于冰上。 4.    将112 μL水添加到步骤2的另一半中。将NTC预混合物置于冰上。 5.    将步骤3中的20 μL模板预混合物等分添加到两行标记为GOI的PCR板孔中。 6.    将步骤4中的20 μL NTC预混合物等分添加到两行标记为NTC的PCR板孔中。 7.    给板盖上盖子并贴好标签。（确保标签不会遮挡仪器的激发/检测光路。） 8.    根据以下三步方案操作反应        (*__说明：__*这些条件是对快速循环实验方案的），确保退火温度 定义在适合引物的最低和最高温度（示例显示为 54-70°C）之间的梯度上。重复执行第1-3步40次。扩增后运行标准解离曲线。 | | | | |------------------|-----------|-------| | 快速循环条件 | 温度 (°C) | 时间（秒） | | 初始变性 / 热启动 | 95 | 30 | | __步骤1-3重复40个循环__ | | | | 第1步 | 95 | 5 | | 第2步 | 54–70（梯度） | 15 | | 第3步 | 72 | 10 | 表 P14-36.Ta优化的快速qPCR循环条件。 *__说明：__*使用标准解离曲线实验方案（数据收集）。  __图 P14-19.__每个列用相同Ta的Ta优化所使用的板布局。 *__注意：__*样品和对照在温度梯度上的分布。如果仪器的温度梯度在板柱上垂直向下变化，则需要相应地重新安排样品和对照的布局。 ## 材料 抱歉，发生了意外错误 Response not successful: Received status code 500 __相关文章__ - 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