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脂肪酶活性测定实验方案

原理

脂肪酶活性测定实验方案

用分光光度法在545 nm处测量醌亚胺染料的外观。

单位定义

一个单位指在下述条件下每分钟导致形成一微摩尔甘油(半微摩尔醌亚胺染料)所需要的酶量。

方法

试剂

操作流程

(第1步)

  1. 将2.0 mL橄榄油乳剂(A)吸移到试管中,在37 ℃下平衡约5分钟。
  1. 加入0.2 mL酶溶液*并混合。
  2. 在37 ℃下反应15分钟后,加入2.0 mL TCA溶液(E)以终止反应,并用滤纸(Toyo-Roshi No.131或Whatman No.42)过滤除去沉淀物。

(第2步)

  1. 将所获得的0.05 mL滤液转移到试管中。
  2. 加入3.0 mL显色试剂(G),37 ℃下孵育15分钟。
  3. 对照水,测量545nm处的光密度(OD测试)。

与此同时,制备空白试剂:在37 ℃下用2.0 mL TCA溶液孵育15分钟后,首先混合2.0 mL橄榄油乳剂(A),然后加入酶溶液(第1步)。使用从混合物获得的滤液,按照与测试相同的程序步骤进行第2步,并测量545nm处的光密度(OD空白)。

* 将酶制剂溶解于冰冷的酶稀释剂(H)中,并在测定前立即用相同的缓冲液稀释至0.4 - 1.2 U/mL。

计算

可以使用以下公式计算活性:

体积活性计算

重量活性(U/mg)=(U/mL)×1/C

此操作方案仅供参考。

材料
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