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α-淀粉酶酶促测定 (EC 3.2.1.1)

概述:α-淀粉酶活性的测定

本操作规程可以用来测定α-淀粉酶的活性。

分光光度终止反应测定法(A540,光程 = 1 cm)基于以下反应:

α-淀粉酶

单位定义:在pH 6.9、温度20 °C条件下,一个单位可在3分钟内从淀粉中释放出1.0 mg麦芽糖。

所需试剂和设备

磷酸一氢钠,产品编号S0751

氯化钠,产品编号S9888

马铃薯淀粉,产品编号S2004

氢氧化钠,产品编号S5881

酒石酸钾钠,四水化合物,产品编号S2377

3,5-二硝基水杨酸,产品编号D0550

D‑(+)‑麦芽糖,一水化合物,产品编号M9171

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书,获取危害和安全操作方法相关信息。

制备说明

使用超纯水(25°C时电阻率 ≥ 18 MΩ×cm)制备试剂。

缓冲液(20 °C,20 mM磷酸钠与6.7 mM氯化钠,pH 6.9)— 用超纯水制备含有2.4 mg/mL 磷酸一氢钠(产品编号:S0751)、和0.39 mg/mL氯化钠(产品编号:S9888)的溶液。 在20 °C,用1 M NaOH/1 M HCl将pH值调节为6.9。

淀粉溶液 [1.0% (w/v) 可溶性淀粉溶液] — 用缓冲液和马铃薯淀粉(产品编号:S2004)制备10 mg/mL的溶液:

  • 在加热 / 搅拌器上,边搅拌边加热至沸腾15分钟使溶液完全溶解。
  • 从加热 / 搅拌器上取下来。继续搅拌该溶液直到降至室温。
  • 用超纯水将溶液定容。
  • 在整个测定程序中持续搅拌溶液。

2 M氢氧化钠(NaOH)溶液 — 用超纯水和氢氧化钠(产品编号:S5881)制备80 mg/mL的溶液。

5.3 M酒石酸钾钠四水化合物溶液 — 用2 M氢氧化钠(NaOH)溶液和酒石酸钾钠四水化合物(产品编号:S2377)制备1,496 mg/mL的溶液。 将溶液放在加热/搅拌器上,边搅拌边加热使固体物质溶解。请勿加热至沸腾!

96 mM 3,5-二硝基水杨酸溶液 — 用超纯水和3,5‑二硝基水杨酸(产品编号:D0550)制备21.9 mg/mL的溶液。 将溶液放在加热/搅拌器上,边搅拌边加热使固体物质溶解。请勿加热至沸腾!

显色剂溶液 — 制备40 mL, 加入:

  • 将12.0 mL 温热(50–70 °C)超纯水添加至大小合适的琥珀色瓶子里。
    边搅拌边慢慢添加:
  • 8.0 mL温热的5.3 M酒石酸钾钠四水化合物溶液
  • 20.0 mL温热的96 mM 3,5-二硝基水杨酸溶液

该溶液在室温避光条件下可以保持稳定6个月。可以视需要调整制备的体积。

0.2% (w/v) 麦芽糖标准溶液 — 在容量瓶里用超纯水和D‑(+)‑麦芽糖一水化合物(产品编号:M9171)制备2 mg/mL的溶液。

α-淀粉酶样品溶液 — 20 °C下用超纯水制备含有0.75‑1.5 个单位/mL α-淀粉酶的溶液,制备完成后立即使用。

操作流程

最终测定浓度 — 在2.00 mL反应体积中,最终浓度为0.50% (w/v) 淀粉和约1个单位的α-淀粉酶。

1. α-淀粉酶样品测定

a. 用移液枪 (mL计) 将以下试剂转移到合适的容器中:

b. 涡旋混合并平衡至20 °C。然后加入(mL计):

c. 涡旋混合并在20 °C刚好孵育3.0分钟。然后加入:

d. 用可以排气的盖子盖好容器,放入沸水浴刚好15分钟。

e. 从沸水浴中取出容器。然后添加(mL):

f. 在冰上使溶液降至室温。

g. 然后添加(mL计):

h. 倒置混合。将合适的分光光度仪在540nm以空气归零,并记录样品空白样品的A540读数。

2.作标准曲线

a. 用移液枪(mL计)将以下试剂移入合适的容器,以作出标准曲线:

说明:可以视需要添加更多的标准溶液。

b. 用可以排气的盖子盖好容器,放入沸水浴刚好15分钟。

c. 从沸水浴中取出容器。在冰上使溶液降至室温。

d. 然后添加(mL计):

e. 倒置混合。将合适的分光光度仪在540nm以空气归零,并记录标样和空白标样的A540读数。

结果

计算

  1. 确定每个标样空白标样之间的差值ΔA540
    ΔA540 (标样) = A540 (标样) – A540 (空白标样)
  2. 用线性回归法制作标准曲线,即绘制标样ΔA540与麦芽糖mg数的关系曲线。
  3. 确定每个样品空白样品之间的差值ΔA540
    ΔA540 (样品) = A540 (样品) – A540 (空白样品)
  4. 用标准曲线确定释放的麦芽糖mg数。

amylase-eq2

式中:
df = 稀释倍数 mL酶 = 在步骤1b中加入的样品mL量。

6.

amylase-eq3
材料
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参考文献

1.
Bernfeld P. 1955. [17] Amylases, ? and ?.149-158. http://dx.doi.org/10.1016/0076-6879(55)01021-5