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主页酶活性测定改良Boehenger法酶促检测α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)

改良Boehenger法酶促检测α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)

文档记录

参见QUMAS 变更申请号SOP-DEK-ENZ53。

1.目标

在Sigma-Aldrich(圣路易斯州)建立改良Boehenger法酶促检测α-葡萄糖苷酶的标准流程。

2.适用范围

该流程适用于可检测α-葡萄糖苷酶活性的所有产品。

3.定义

3.1纯水 – 来自去离子系统的水,电阻率>或= 18MΩ•cm @ 25 ºC

3.2.单位定义 – 在pH 6.0、温度25°C条件下,一个单位每分钟可将1.0微摩麦芽糖转化为2 mole D-葡萄糖。

3.3.ATP –腺苷-5'-三磷酸

3.4.ATP –腺苷-5'-二磷酸

3.5.G-6-P –萄糖-6-磷酸

3.6.NADP+ – β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化形式)

3.7.NADP+ –β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原形式)

3.8.G-6-PDH –葡萄糖-6-磷酸脱氢酶

4.讨论

麦芽糖 + H2O α – 葡萄糖苷酶> 2(α - D – 葡萄糖)

2(α - D – 葡萄糖) + 2(ATP)己糖激酶> 2(G - 6 - P) + 2(ADP)

2(G - 6 - P) + 2NADP+ G-6-PDH> 2(6 -磷酸葡萄糖酸) + 2(NADPH) + 2H+

5.责任

任何分析服务实验室人员有责任遵守本文所述流程。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 条件:
温度= 25°C,pH = 6.0,A340nm,光程= 1 cm

7.2 方法:
光谱法终止/终点测定

7.3 试剂:

7.3.1 7.3.1.100 mM醋酸钠,0.05% (w/v)四水合物无水乙二胺四乙酸四钠,pH 6.0, 25 °C(缓冲液)
采用纯水,制备13.61 mg/ml三水合物醋酸钠(Sigma-Aldrich货号S8625)溶液和0.55 mg/ml四水合物无水乙二胺四乙酸四钠(Sigma-Aldrich货号ED4SS)溶液。将pH在25 °C下调至6.0。

7.3.2 20% (w/v)麦芽糖 采用纯水和I级一水麦芽糖(Sigma-Aldrich货号 M5885)制备200 mg/ml的溶液。

7.3.3 葡萄糖HK检测试剂(HK) 使用前,按照标签上标示的体积,现场溶解一瓶葡萄糖(HK)检测试剂(Sigma-Aldrich货号G3293)。

7.3.4 α-葡萄糖苷酶(酶) 临加入反应混合物之前,采用低温纯水现配含3-5 units/ml的溶液。

7.4 步骤 1 – 酶终止反应

7.4.1 启动沸水浴,加热至沸腾。.

7.4.2 将下列试剂(ml)加入适宜的容器中:

7.4.3. 倒置混匀,等待温度调至25 °C,然后加入:

7.4.4. 涡旋混匀,在25 °C水浴中孵育整整5分钟。涡旋混匀,在25 °C水浴中孵育整整5分钟。5分钟沸水浴后,加入:

7.4.5. 再沸水浴5分钟,然后离心5分钟。倒入第7.5步(步骤2)所用的上清液。

7.5.7.4 步骤 2 – 酶活性测定

7.5.1. 将下列试剂(mL)加入适宜的培养皿中:

7.5.2. 使用适宜的恒温光谱分析仪调整至25 °C,记录所有试样和空白样反应混合物的初始A340 nm (AI)。然后添加:

7.5.3. 倒置混匀,监测A340 nm增量,直至Δ A340 nm/min≤0.0020,此速率须至少维持5分钟。记录最终的A340 nm (AF)。校正后的A340nm应处于0.20至0.55范围内。

7.6 计算

7.6.1 ΔA = AF - AI

7.6.2单位/mL 酶=

(ΔA 试样 - ΔA 空白样)(3.00) (2.00) (df)


(6.22)(2)(0.10)(5)(mg 酶)

7.6.3. 3.00 = 第7.5步(步骤1)中的反应混合物体积(ml)
2.00 = 第7.4步(步骤2)中的反应混合物体积(ml) df = 酶稀释系数 6.22 = NADPH的毫摩消光系数 2 = 每µmole麦芽糖的NADPHµmole数 0.10 = 第7.4步(步骤1)反应混合物中所用的酶体积 0.10 = 第7.5步(步骤2)反应混合物中所用的酶体积 5 = 孵育时间(min)

7.7最终检测体系浓度:
NA

8.参考文献和附件

NA

9审批

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材料
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