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醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)的酶学测定

描述

该方法适用于醇脱氢酶产物,但不溶形式的醇脱氢酶(货号A2529)除外。

连续分光光度法测定(A340,光路= 1 cm)是基于以下反应:

醇脱氢酶反应

β-NAD = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,氧化
β-NADH = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,还原

单位定义:一个单位的醇脱氢酶在pH 8.8、25℃下,每分钟将1.0 μmole乙醇转化为乙醛。

所需试剂和设备

磷酸(货号438081)
焦磷酸四钠 十水化合物(货号221368) 乙醇95%(v/v)(货号493538) β-NAD水合物(货号N6522) 磷酸一氢钠(货号S9638) 5 M磷酸一氢钠(货号74092) 磷酸二氢钠(货号S9763) 0.5 M磷酸二氢钠(货号94046) 牛血清白蛋白(货号A9647)

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书,获取危害和安全操作方法相关信息。

制备说明

使用超纯水(25 °C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率)制备试剂。

9.5%(v/v)磷酸 — 在纯水中制备0.095 mL/mL磷酸(货号438081)溶液。

50 mM磷酸钠缓冲液,pH 8.8(25℃) — 在超纯水中制备22.3 mg/mL焦磷酸四钠 十水化合物(货号221368)溶液。在25℃下用9.5%(v/v)磷酸将pH调节至8.8。

乙醇95%(v/v)(货号493538)

15 mM β-NAD(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)溶液 — 在超纯水中制备11.6 mg/mL的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物(货号N6522)溶液。

10 mM磷酸钠缓冲液,pH 7.5(25℃)— 制备500 mL缓冲液:加入21.0 mL 0.2 M磷酸二氢钠溶液,该溶液由0.5 M磷酸二氢钠溶液(货号94046)制备而来。然后加入4.0 mL 0.2 M磷酸一氢钠溶液,该溶液由5 M磷酸一氢钠溶液(货号74092)制备而来。最后用超纯水定容500 mL。在25 °C下用1 M NaOH或1 M HCl将pH值调节至pH 7.5。

酶稀释液(10 mM磷酸钠缓冲液,pH 7.5,含0.1%(w/v)牛血清白蛋白)— 在10 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中制备1 mg/mL牛血清白蛋白(货号A9647)溶液。 用1 M NaOH或1M HCl将pH调节至7.5(25°C)。

ADH原液 — 在pH 7.5的冷(2-8°C)10 mM磷酸钠缓冲液中制备1 mg/mL醇脱氢酶溶液。
注意:新鲜制备

ADH工作溶液 — 在使用前,立即用冷酶稀释液将0.050 mL ADH原液稀释至25.0 mL。
注意:新鲜制备

注意:如果该酶浓度产生ΔA340/分钟 > 0.15,则用冷酶稀释液将0.050 mL ADH原液稀释至50.0 mL。如果测定粗产物,则仅相应修改酶稀释方案。

操作流程

在3.00 mL反应混合物中,最终浓度为22 mM焦磷酸钠,3.2%(v/v)乙醇,7.5 mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,0.3 mM磷酸钠,0.003%(w/v)牛血清白蛋白,和0.001-0.002 mg/ml醇脱氢酶。

1.在合适的比色皿中,准确移取以下物质:

2.倒置混合。将比色皿放入适当恒温的分光光度计中平衡至25℃。

3.然后添加:

4.立即通过倒置混合,并记录6分钟内的A340增量。

5.对于测试和空白,使用1-6分钟的范围获得A340/分钟。

结果

计算

1.

单位/ml酶 = (ΔA340/分钟 检测 – ΔA340/分钟 空白) (3.0) (df)
(6.22) (0.1)

3.0 = 测定的总体积(mL)
df = 稀释因子 6.22 = 在340 nm处的毫摩尔β-NADH消光系数 0.1 = 使用的酶溶液的体积(mL)

2.

单位/mg固体 =单位/ml酶
mg固体/ml酶
材料
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参考文献

1.
Kagi J, Vallee B. 1960. The Role of Zinc in Alcohol Dehydrogenase. J Biol Chem. 235(11):3188-3192.