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主页酶活性测定淀粉葡萄糖苷酶的酶学测定(EC 3.2.1.3)

淀粉葡萄糖苷酶的酶学测定
(EC 3.2.1.3)

描述

本操作程序可用于使用淀粉作为底物测定淀粉葡萄糖苷酶的活性。分光光度法停止速率测定 [340 nm处的吸光度(A340),光程= 1cm] 基于以下反应:

淀粉葡萄糖苷酶
淀粉+水 ––––––––––––––––> D-葡萄糖


己糖激酶
D-葡萄糖 + ATP ––––––––––> 葡萄糖-6-磷酸盐 + ADP


G-6-PDH
葡萄糖-6-磷酸盐 + β-NADP ––––––––––> 6-PG + β-NADPH


ADP - 二磷酸腺苷
ATP - 三磷酸腺苷 G-6-PDH ​​- 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 β-NADP - β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐,氧化形式 β-NADPH - β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐,还原形式 6-PG - 6-磷酸-D-葡糖酸盐

单位定义 — 一个单位的淀粉葡萄糖苷酶在pH 4.5、55 °C下,在3分钟内从淀粉中释放1.0 mg葡萄糖。

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书,获取危害和安全操作方法相关信息。

所需试剂和设备

三水合乙酸钠(货号S8625)
马铃薯淀粉(货号S2004)
6.1 N三氯乙酸溶液[~100% (w/v),货号T0699]
葡萄糖测定试剂(货号G3293)
碳酸氢钠(货号S8875)

制备说明

使用超纯水(25 °C时≥18 MΩxcm电阻率)制备试剂。

缓冲液(50 mM乙酸钠,pH 4.5,55 °C)— 使用三水合乙酸钠(货号S8625)在超纯水中制备6.8 mg/mL溶液。在55 °C下,使用1 M HCl调整pH至4.5。

淀粉溶液 [1%(w/v)] — 用马铃薯淀粉(货号S2004)在缓冲液中制备10 mg/mL溶液。在60-80 °C下加热约15分钟以促进溶解。不要煮沸。在整个测定过程中使溶液缓慢混合。

酶溶液(淀粉葡萄糖苷酶)— 在即将使用前,在冷的超纯水中制备溶液(0.40 - 0.80 mg固体/mL)。然后立即在55 °C纯水中稀释至0.3 - 0.6单位/mL淀粉葡萄糖苷酶。最终反应混合物必须含有0.15 - 0.60单位的淀粉葡萄糖苷酶。

TCA溶液 [(50%(w/v)三氯乙酸溶液] — 在超纯水中制备2倍稀释的6.1 N三氯乙酸溶液[~100% (w/v),货号T0699]。

葡萄糖测定试剂(HK)— 在即将使用前,用超纯水溶解一小管葡萄糖测定试剂(货号G3293)的内容物,使用标签上包装大小所示的体积。

操作流程

在2.00 mL反应混合物中,最终浓度为25 mM乙酸钠、0.5%(w/v)淀粉和0.15–0.60单位淀粉葡萄糖苷酶。

酶促停止反应

1.将下列试剂移至合适的容器中:

2.平衡到55 °C。然后添加:

3.立即旋流混匀并在55 °C孵育刚好3分钟。然后添加:

4.涡旋混合,并用固体碳酸氢钠(货号S8875)调节至pH 7.0。

5.通过0.1 μM PVDF注射器式滤器(货号F7523)过滤,并在酶活性测定步骤4中使用滤液。

酶活性测定

1.移取以下试剂到合适的比色皿中:

2.平衡至25 °C。使用合适的恒温分光光度计监测A340 ,直至恒定。

3.记录测试和空白试样的初始A340 。

4.然后添加:

5.立即倒置混合。监测A340 ,直到DA340 /min < 0.0020,并且此速率保持至少5分钟。

6.记录测试和空白试样的最终A340 。

结果

计算

1.ΔA340 = A340 最终 – A340 初始

2.

式中:

180 = 每微摩尔葡萄糖的葡萄糖微克数
2.3 = 酶促终止反应的总体积(以毫升计),步骤1-5 3.0 = 酶活性测定的总体积(以毫升计),步骤1-6 df = 稀释因子 6.22 = β-NADPH在340 nm处的毫摩尔消光系数 1,000 = 从微克到毫克的转换系数 ml酶 = 在酶促终止反应中添加的酶溶液的体积,步骤2 0.20 = 用于酶活性测定的酶促终止反应的体积(以毫升计)

3.

材料
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03/14-1

参考文献

1.
1963. Bergmayer, H. U.: Methods of Enzymatic AnalysisVerlag Chemie G.m.b.H., Weinheim/Bergstr.(Germany) and Academic Press, New York and London.1963, XXIV, 1064 pages with 78 figures, 4 colored diagrams and 41 tables.Clothbound DM 120.? = $ 30.00. Starch/Stärke. 15(7):272-272. https://doi.org/10.1002/star.19630150713