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抑肽酶酶活测定

1.目标

建立抑肽酶酶活测定的标准化操作步骤。

2.适用范围

该流程适用于可检测抑肽酶活性的所有产品。

3.定义

3.1 在pH 7.8、25 ºC条件下一个胰蛋白酶抑制剂单位(TIU)可将2单位胰蛋白酶活性降低50%,其中一单位的胰蛋白酶每分钟可以水解1.0 μmole的N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺盐酸盐(BAPNA)。

3.2纯水 – 经去离子系统处理的水,在25 ºC的电阻率大于或等于18MΩ•cm

4.讨论

抑肽酶可以抑制以下反应:

N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺 胰蛋白酶 > Nα-苯甲酰-DL-精氨酰 + 对硝基苯胺

5.责任

分析服务实验室人员应按照书面规定执行此程序。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 条件
温度= 25°C,pH = 7.8,A405nm,光程= 1 cm

7.2 方法
连续分光光度速率测定

7.3试剂:

7.3.1 200 mM三羟乙基胺缓冲液,20 mM氯化钙,pH 7.8,25 °C(缓冲液) 采用纯水、三乙醇胺盐酸盐(货号如T1502)溶液和二水氯化钙(货号如C3881)制备37.1 mg/mL溶液。在25 ℃下用1 M NaOH调节至pH 7.8。)

7.3.2 N-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺溶液(BAPNA
采用纯水和Nα-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺(货号如B4875)制备1.0 mg/mL溶液。

7.3.2.1 使用前和使用期间,将溶液25 °C储存,确保运行期间核心反应混合物处于25 °C。

7.3.2.2 如果溶液混浊,温和加热继续搅拌(但不要超过65ºC),直至溶液变澄清。请勿使用变黄的溶液,因为这表示底物因过热而出现化学分解。

7.3.3 1 mM 盐酸溶液(HCl
在纯水中使用例如货号H3162制备100 mL。

7.3.4 胰蛋白酶溶液(胰蛋白酶
临使用前,采用低温的试剂7.3.4(HCl)制备一份含1040-1560单位/mL胰蛋白酶(III型,货号T4665或同等制剂)的溶液。

7.3.4.1 未抑制情况下的速率必须是具有介于0.08-0.12之间的∆A405nm/min。采用低温的试剂7.3.4(HCl)制备调整试剂试剂7.3.4(胰蛋白酶)的浓度,直至结果处于此范围内。

7.3.5 0.85% (w/v) 氯化钠溶液(NaCl
使用纯的货号S0817或同等制剂。

7.3.6 抑肽酶抑制剂溶液(抑制剂
临使用前,采用低温的试剂(NaCl)制备含0.065-0.080 TIU/mL的溶液。

7.3.6.1 为保证检测有效,抑制百分比(%)必须介于40和60%之间。使用低温试剂7.3.5(NaCl)调整试剂7.3.6(抑制剂)浓度,直至结果处于此范围内。

7.4 测定方法

7.4.1 移取以下试剂到合适的比色皿中:

7.4.3 倒置混匀,等待温度调至25 °C。使用适宜的恒温分光光谱仪监测A405nm直至最后恒定。然后添加:

试剂 7.3.2(BAPNA1.0001.0001.000

7.4.3 立即倒置混匀,记录大约5分钟内的A405nm增量。根据未抑制试样的最大线性速率获取∆ A405nm/min值,然后采用相同方法计算抑制试样和空白溶液的A405nm/min。

7.5 计算

TIU/mL =(Δa405nm/minute405nm/minute 未抑制 - ΔA405nm/minute 抑制)(df)
(9.96)(mL 抑肽酶/mL RM)


式中:
TIU = 胰蛋白酶抑制剂单位
df = 稀释系数 9.96 = 对硝基胺苯在405nm处的摩尔消光系数 RM = 反应混合物

TIU/mg 固体 =TIU/mL
mg固体/mL

抑制率(%)=(Δa405nm/minute405nm/minute 未抑制 - ΔA405nm/minute 抑制) X 100
(ΔA405nm/minute 未抑制 - ΔA405nm/minute 空白)

7.6最终检测浓度
在3.00 mL反应混合物中,终浓度为107 mM三乙醇胺、11 mM氯化钙、0.03% (w/v) Nα-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯酰胺、0.07 mM盐酸、208-312单位胰蛋白酶、0.057% (w/v)氯化钠和0.013 – 0.015胰蛋白酶抑制剂单位抑肽酶。

8.参考文献

8.1 Fritz, H., Hartwich, G., Werle, E., Hoppe-Seylers Zeitschrift Für Physiologishche Chemie (Berlin) 345, 150-167 (1966).

8.2 Kassell, B., Methods in Enzymology XIX, 844-852 (1970).

材料
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