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主页酶活性测定胆固醇氧化酶的酶学测定

胆固醇氧化酶的酶学测定

1.目标

建立胆固醇氧化酶酶促测定的标准化操作流程。

2.适用范围

本操作流程适用于所有测定胆固醇氧化酶促活性参数的产品。本测定法不适用于测定来自裂褶菌(Schizophyllum commune)(已停产的货号C7274)和短杆菌属(Brevibacterium sp.)(已停产的货号C8153)。

3.定义

3.1 ODA — 邻联茴香胺

3.2 POD — 过氧化物酶

3.3 纯水 = 来自去离子系统的水,电阻率 >或= 18MΩ•cm @25 ºC。

3.4 过氧化物酶单位定义 — 一个单位将在pH 6.0、20 °C下,在20秒钟内形成1.0 Mg红陪酚。

4.讨论

胆固醇 + O2 胆固醇氧化酶 > H2O2 + 4-胆甾烯-3-酮
H2O2 + 邻联茴香胺(还原型) POD > 2 H2O + 邻联茴香胺(氧化型)

5.责任

分析服务实验室人员应遵循本书面操作流程。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项,请参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 条件:
T = 25°C,pH = 7.5,A500nm,光程= 1 cm

7.2 方法:
连续光谱法速率测定

7.3 试剂:

7.3.1 50 mM磷酸钾缓冲液,pH 7.5,25 °C(缓冲液
利用纯水和磷酸钾(货号如P5379)配制6.8 Mg/mL的溶液。用 1 M KOH 在 25 °C 调节 pH 至 7.5。

7.3.2 1%(w/v)邻联茴香胺溶液(ODA)
利用试剂7.3.1(缓冲液)和邻联茴香胺(如货号D9154)配制10.0 mg/ml的溶液。(新鲜制备)

7.3.3 0.5% (w/v) 胆固醇与10%(w/v)Trition X-100溶液(胆固醇
首先将500 mg胆固醇(如货号C8503)溶于10 mL Triton X-100(如货号X-100)中。 边搅拌边加热,直至溶液变得澄清。然后缓慢加入已温热至70-80 °C的90 ml纯水。继续在70-80 °C下搅拌溶液10分钟。加入水后溶液可能会变浑浊,但仍可用于测定。

7.3.4 过氧化物酶溶液(POD)
临使用前,利用纯水和过氧化物酶(货号P8250)配制100 pyrogallol单位/ml的溶液。

7.3.5 胆固醇氧化酶溶液(
临使用前,利用低温试剂7.3.1和胆固醇氧化酶配制0.1-0.2单位/mL的溶液。

7.4 测定方法

7.4.1 将下列试剂(mL)移液到合适的容器,以制备反应混合物:

7.4.2 涡旋彻底混合,然后在25 °C下用0.1 M HCl或KOH调节至pH7.5(如果需要的话)。加入试剂7.3.1至50 mL终体积,涡旋充分混合,并在使用前充氧约10分钟。

7.4.3 移取以下试剂(单位mL)到合适的比色皿中:

7.4.4 倒置混合,并在适当恒温的分光光度计中平衡至25℃。监测A500nM恒定之前的状态。然后添加:

立即通过倒置混合,并记录约5分钟内A500nm的增量。利用试样和空白样的最大线性速率获取ΔA500nm/min结果。

7.5 计算

7.6 单位定义

7.6.1 在pH7.5、25℃下,一单位每分钟可将1.0 μmol胆固醇转化为4-胆甾烯-3-酮。

7.6.2 注意:4-胆甾烯-3-酮可能会发生异构化。

7.7 最终检测浓度:
在3.0 mL反应混合物中,终浓度为46 mM磷酸钾、0.009%邻联茴香胺、0.017%(w/v)胆固醇、0.33%(v/v)Triton X-100、10单位过氧化物酶和0.01 - 0.02单位胆固醇氧化酶。

材料
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