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α-胰凝乳蛋白酶的酶学测定程序(EC 3.4.21.1)

描述

本操作程序可用于使用N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯(BTEE)作为底物测定α-胰凝乳蛋白酶活性。它不适用于测定α-胰凝乳蛋白酶琼脂糖(货号C9134)。本方案是基于以下反应的连续分光光度速率测定(A256,光程= 1 cm)方案:

α-胰凝乳蛋白酶活性

式中:
BTEE - N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯

单位定义 — 一个单位的α-胰凝乳蛋白酶在pH7.8、25℃条件下每分钟水解1.0 μmole的BTEE。

所需试剂和设备

Trizma®碱(货号T1503

N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯(货号B6125

甲醇(货号M1775

氯化钙二水合物(货号C3881

盐酸水溶液(货号H9892

注意事项 — 有关有害物及其安全处理方法的信息,请参阅安全数据表。

制备说明

使用超纯水(25°C时 ≥ 18 MΩ×cm)制备试剂。

缓冲液(80 mM Trizma碱缓冲液,pH7.8,25 ℃)— 用超纯水和1.0 M Trizma碱缓冲液原液(货号T1503)制备12.5倍稀释液。在25°C下用1 M HCl或1 M NaOH将pH调节至7.8。

BTEE溶液(1.18 mM N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯)— 制备100 mL:

  • 称取37.0±0.5 mg N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯(货号B6125)置入100 mL A级容量瓶中。
  • 加入63.4 mL甲醇(货号M1775)并涡旋混合。
  • 用超纯水将溶液最后定容至100 mL。
  • 盖上烧瓶口并倒置几次以确保完全混合。
    注意:可以视需要调整制备的体积。

CaCl2溶液(2 M氯化钙)— 在超纯水中用氯化钙二水合物(货号C3881)制备294 mg/mL溶液。

HCl溶液(1 mM盐酸)— 在100 mL A级容量瓶中,用超纯水将1 M盐酸溶液(货号H9892)稀释1,000倍。盖上烧瓶口并倒置几次以确保完全混合。将溶液置于冰上

酶溶液(α-胰凝乳蛋白酶)— 在使用前,立即在冷的(2-8 ℃)HCl溶液中制备含有2-5 α-胰凝乳蛋白酶单位/mL的溶液。

操作流程

在3.00 mL反应混合物中,最终浓度为38 mM Tris,0.55 mM N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯,30%(v/v)甲醇,53 mM氯化钙,0.03 mM盐酸和0.2-0.5单位的α-胰凝乳蛋白酶。

1.移取以下试剂到合适的石英比色皿中:

2.倒置混合,并在已经对照空气归零的适当恒温的分光光度计中平衡至25 ℃。

3.移取以下试剂到比色皿中:

4.立即通过倒置混合,并记录5分钟内的A256增量。

5.确定空白和测试反应物的ΔA256/分钟,使用一分钟时间间隔内的最大线性速率和至少4个数据点。

结果

计算

1.

胰凝乳蛋白酶计算公式

式中:

TV = 比色皿中反应混合物的总体积(mL)
df = 稀释因子 0.964 = BTEE在256 nm时的毫摩尔消光系数 VTest = 测定中使用的酶溶液的体积(mL)

2.

胰凝乳蛋白酶计算2公式
材料
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参考文献

1.
Wirnt R, Bergmeyer HU. 1974. Methods of Enzymatic Analysis. New York: Academic Press.