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主页酶活性测定酯酶的酶促测定

酯酶的酶促测定

1.目标

建立使用丁酸乙酯作为底物对酶促测定酯酶活性的标准化方法。

2.适用范围

该流程适用于可检测酯酶活性的所有产品。

3.定义

3.1.纯水 - 来自去离子系统的水,电阻率~18MΩּcm@ 25 °C

3.2.活力单位定义 - 一个单位可在pH8.0、25 ºC下每分钟将1.0 μmole丁酸乙酯水解成丁酸和乙醇

4.讨论

丁酸乙酯 + H2O 酯酶 >丁酸+乙醇

5.责任

分析服务实验室人员应按照书面规定执行此程序。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1.条件
T = 25℃,pH 8.0

7.2.方法 滴定速率测定

7.3.试剂:

7.3.1 10mM硼酸盐缓冲液(缓冲液) 使用硼酸(例如Sigma-Aldrich货号B0252)在纯水中制备0.62 mg/mL溶液。用1N NaOH将pH调节至8.0

7.3.2 丁酸乙酯(EB Neat) 使用丁酸乙酯(例如Sigma-Aldrich货号E15701)进行制备。

7.3.3 标准化氢氧化钠 使用1 N氢氧化钠(例如Sigma-Aldric货号S2567)在纯净水中制备合适的稀释液。

7.3.4 0.01 N氢氧化钠滴定液(NaOH) 使用标准化的试剂7.3.3在纯净水中制备0.01 N氢氧化钠溶液。须现配现用。

7.3.5 酯酶溶液(酶) 在使用前,立即在冷试剂7.3.1中制备含约50单位/mL的溶液。

7.4.流程

7.4.1. 将以下试剂(以毫升计)移液到合适的滴定容器中,并同时使用合适的pH计、磁力搅拌器和恒温水浴:

7.4.2. 在搅拌条件下于25 ℃进行平衡。然后加入以下成分(ml):

7.4.3. 在搅拌条件下于25 ℃进行平衡。使用试剂7.3.4(NaOH)将pH调节在8.1-8.2的范围内。然后加入以下成分(ml):

7.4.4. 监测反应混合物的pH,直至pH达到8.0。此时,在累积模式下使用计时器,同时添加0.100mL试剂7.3.4(NaOH)并启动计时器。(如步骤7.4.6所述,可根据需要调整NaOH滴定剂的等分试样)

7.4.5. 当反应混合物的pH值再次达到8.0时,再加入0.100mL试剂7.3.4(NaOH)的等分试样(或与7.4.4中所使用的相同体积),并记录所经过的时间。

7.4.6. 重复步骤7.4.4和7.4.5约5分钟。在此期间应该添加大约10次滴定剂。并且至少需要添加5次滴定剂。如果未满足最低添加要求,请调整步骤7.4.4和7.4.5中使用的滴定剂体积。

7.4.7. 将所用滴定剂的体积(以毫升计)与时间(以分钟计)进行作图,并确定每个样品和对照组图的斜率。

7.4.8. 按照步骤7.4.1至7.4.4进行空白实验,用纯净水(酶稀释剂)替换酶等分试样。如果反应混合物的pH在60分钟内没有达到8.0,则将记录60分钟作为空白速率。该时间(Tb)需用于计算。空白实验可在样品之前进行。如果空白速率几乎可以忽略不计,则可以使用另一个计时器并将空白反应混合物放在一边。但应在样品实验之间定期检查pH值。

7.5 计算

7.5.1. 斜率可通过将试剂7.3.4(NaOH)的0.100mL(或步骤7.4.4和7.4.5中使用的体积)等分试样的消耗速率除以时间获得。

空白速率修正:T =(m) - (VT / Tb)

VT = 用于将反应混合物的pH保持在8.0所需试剂7.3.4(NaOH)的体积(以毫升计)
NNaOH = 试剂7.3.4(NaOH)的一般工作浓度 1000 = 从毫摩尔转换为微摩尔的转换比例 m = 从7.5.1中所得的斜率 Tb = 从7.4.8中所得的空白组经过时间 0.1 = 使用的酶的体积(以毫升计)

7.6 初始分析浓度 在25.200mL反应混合物中,初始浓度为10mM硼酸盐、0.4%(v/v)乙酸丁酯和5单位酯酶。

材料
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