Merck
主页酶活性测定己糖激酶的酶促检测

己糖激酶的酶促检测

目标

建立己糖激酶酶促测定的标准化操作流程。

适用范围

本操作流程适用于大多数遵酶促测定糖激酶参数的产品1

定义

ATP =5'-三磷酸腺苷
ADP =5'-二磷酸腺苷
G-6-PDH =葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
β-NADP =β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐,氧化形式
β-NADPH =β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐,还原形式
6-PG = 6-磷酸-D-葡糖酸盐

反应

D-葡萄糖 + ATP 己糖激酶 > D-葡萄糖-6-磷酸+ ADP
D-葡萄糖-6-磷酸 + β-NADP G-6-PDH >6-PG + β-NADPH

操作流程

条件:T = 25°C,pH = 7.6,A340nm,光程 = 1 cm

方法:连续光谱法速率测定

试剂:

试剂 A: 50 mM三羟乙基胺缓冲液,pH 7.6、25 °C(缓冲液).用去离子水和盐酸三羟乙基胺盐(货号T1502)配制100 mL溶液。在25 ℃下用1 M NaOH调节至pH 7.6。

试剂B:555 mM D-葡萄糖溶液(D-葡萄糖)。利用试剂A和D-(+)-无水葡萄糖(货号G8270)配制10mL溶液。

试剂C:19 mM 5'-三磷酸腺苷溶液(ATP)。用去离子水和5'三磷酸腺苷二钠盐(货号A2383)配制10 mL溶液(新鲜配制)。

试剂D:100 mM 氯化镁溶液(MgCl2)。用去离子水和氯化镁溶液(货号M1028)配制5 mL溶液。

试剂E:14 mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐溶液,氧化形式(β-NADP)。用去离子水和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐(货号N0505)配制10 mL溶液(新鲜配制)。

试剂F:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液 (G 6 PDH)。2临使用前,利用试剂A和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(货号G4134)配制125单位/mL的溶液。3

试剂G:己糖激酶酶溶液。临时用前,利用低温去离子水和纤维素酶配制中制备0.51.0单位/ml的溶液。)

测试方法:

将下列试剂(mL)加入适宜的培养皿中:

倒置混合并平衡至25 °C。使用合适的恒温分光光度计检监测A340nm直至恒定。然后添加:

立即倒置混匀,并记录5分钟内的A340nm增量。使用检测组和空白对照的最大线性率算出ΔA340nm/分钟。

计算方法:

2.57 =反应体系总体积(mL)
df =稀释系数 6.22 =β-NADPH的在340nm处的毫摩尔消光系数
0.05 =所用的酶体积(mL)

单位定义
在pH 7.6、25 °C条件下,一单位每分钟可磷酸化1.0 μmole的D-葡萄糖。

检测体系终浓度:
在2.57ml反应混合物中,终浓度为39mM三乙醇胺,216mM D-葡萄糖,0.74mM 5'-三磷酸腺苷,7.8mM 氯化镁,1.1mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,2.5单位葡萄糖6磷酸脱氢酶,和0.025-0.05单位的己糖激酶。

注意

  1. 该方法不能用于测定己糖激酶(货号H3779)、附着于珠状琼脂糖的不溶性己糖激酶(货号H2005)、附着于聚丙烯酰胺的不溶性己糖激酶(货号H8254)。
  2. 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶单位定义:在pH为 7.4、25 °C、存在β-NADP的条件下,一单位每分钟可将1.0μm的D-葡萄糖6-磷酸氧化成6-磷酸-D-葡萄糖酸盐。
  3. 其他类型的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶可能含有不同量的己糖激酶杂质。 这可能导致高空白率,因此,G-6-PDH必须具有较低的己糖激酶杂质。
材料
Loading

参考文献

1.
Bergmeyer H, Grassl M, Walter H. 1983. in Methods of Enzymatic Analysis. (Bergmeyer, H.U. ed). 3(II):222-223.