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主页酶活性测定转化酶的酶学测定

转化酶的酶学测定

1.目标

建立转化酶酶促测定的标准化操作流程。

2.适用范围

本操作流程适用于所有酶促测定转化酶活性参数的产品。

3.定义

3.1.纯化水 — 去离子水,电阻率 ~ 18MΩ•cm @ 25 ºC

3.2.单位定义 — 在55 ºC、pH 4.5条件下,一单位每分钟可将1.0 μmole的蔗糖水解为转化糖

4.讨论

蔗糖 +H2O 转化酶 >葡萄糖 + 果糖
葡萄糖和果糖均作为还原糖测定。

5.责任

分析服务人员应遵循本书面操作流程。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1.条件:T=55ºC,Abs410,pH=4.5,光程 =1 cm

7.2 方法:
光谱法终止反应

7.3试剂:

7.3.1. 100 mM乙酸钠,pH 4.5, 55ºC(缓冲液)
利用纯水和醋酸钠三水合物(货号S8625)配制13.6 mg/mL的溶液。用1M HCl调节pH(55ºC)。

7.3.2. 1.0%w/v 蔗糖底物(蔗糖)
利用试剂7.3.1和蔗糖(货号S7903)配制10 mg/mL的溶液。须现配现用。

7.3.3. 转化酶(酶)
临使用前,利用低温纯水和转化酶配制0.3-0.4单位/mL的溶液。建议:为了增加样品的溶解度,称量产物到wig-l-bug中并相应地稀释。

7.3.4. 0.5 MNaOH(NaOH)
利用纯水和1 N NaOH(货号S2567)配制1:2 稀释液。

7.3.5. 0.5% w/v PAHBAH(PAHBAH)
利用试剂7.3.4和对羟基苯甲酰肼(货号H9882)配制5 mg/mL的溶液。须现配现用。

7.3.6. 5.56 mM葡萄糖标准溶液(STD SOLN)
利用纯水和葡萄糖标准品(货号G8270)配制1.0 mg/mL的溶液。

7.4 试验方法

7.4.1. 将以下内容(毫升)移入合适的容器中:

7.4.2. 摇动混合并平衡至55 ºC。然后添加:

7.4.3. 摇动混合并在55 ºC培养20分钟整。培养 20 min 后摇动并倒置试管。

7.4.4. 各反应混合物各取0.10mL,加入含有下列内容物的单独试管:

7.4.5. 立即摇动混合。在每个试管上放一个大理石或透气的盖子,然后放入沸水浴中。

7.4.6. 煮试管 5 min。试管可以在反应停止后15分钟内一起煮。

7.4.7. 从沸水浴中取出,冷却至室温。

7.4.8. 旋转混合并将溶液转移到合适的比色皿中。使用合适的分光光度计测量所有反应混合物在410 nm处的吸光度。

7.5 计算

7.5.1. 标准曲线:

校正吸光度:ΔA410nm Std = A410nm Std - A410nm Std Blank

将 ΔA410nm410nm Std与葡萄糖的微摩尔量的相对关系绘制称标准曲线。

7.5.2. 校正的ΔA410nm 测试 =A410nm 测试 - A 410nm 测试空白

式中:
df= 稀释系数
20 = 测定时间(min)
0.1 = 所用的酶体积(mL)
2 = 1 μmol蔗糖水解为葡萄糖和果糖的换算系数

7.5.5.单位/mg 固体 =单位/mL 酶
mg 固体/mL 酶
7.5.6.单位/mg 蛋白 =U单位/mg 固体
mg 蛋白/mg 固体

7.5.7. 检测体系终浓度:
在1.00 mL反应混合物中,终浓度为 90 mM 乙酸钠,0.90% (w/v) 蔗糖和 0.03-0.04单位转化酶。

材料
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