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漆酶的酶学测定(EC 1.10.3.2)

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种铜酶,可氧化各种类型的酚和类似的芳香族化合物芳香胺,并同时将分子氧还原为水,因此可被用作生物催化剂。漆酶活性的分光光度法测定基于的是来自酶促和后续化学反应的产物形成。1

1.目标

为了标准化漆酶酶学测定的程序步骤。

2.适用范围

该程序步骤的范围是所有具有漆酶活性特化的产品。

3.定义

一个单位是指使用丁香醛连氮作为底物,在pH 6.5、30 °C下,3 mL反应体积中每分钟产生0.001的DA530nm。

4.讨论

丁香醛连氮 + O2漆酶> 氧化丁香醛连氮 + 2H2O。

5.责任

分析服务人员有责任遵循本书面实验方案。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项,请参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 条件:
T = 30°C,pH = 6.5,A530nm,光程 = 1 cm

7.2 方法:
连续光谱法速率测定

7.3 试剂:

7.3.1 100 mM磷酸钾缓冲液,pH 6.5,30 °C(缓冲液)
(使用无水磷酸二氢钾,产品编号P-5379,在去离子水中制备成100 mL。在30 °C下用1 M KOH调节至pH 6.5。)

7.3.2 0.216 mM丁香醛连氮溶液(SYR)
(使用丁香醛连氮,产品编号S7896,和无水甲醇制备成3 mL。)

7.3.3 漆酶酶溶液(漆酶)
(在使用前,立即在冷的去离子水中制备含有25-50单位/mL漆酶的溶液。)

7.4 测试方法 将以下试剂移液到合适的小管中(以毫升计):

平衡至30 °C。使用适当恒温的分光光度计监测A530nm直至恒定。然后添加:

反转混合,并记录A530nm的增加约10分钟。获得DA530nm/min。对测试和空白样均使用最大线性速率。

7.5 计算

df = 稀释因子
0.001 = 在pH 6.5、30℃下,3 mL反应混合物中每单位漆酶的变化,其单位为A530nm/min 0.5 = 所使用的酶的体积(以毫升计)

7.6 最终检测体系浓度:
在3.00 mL反应混合物中,终浓度为73 mM磷酸钾,0.02 mM丁香醛连氮,10%甲醇和12.5至25.0单位漆酶。

8.审批

材料
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参考文献

1.
Sheikhi F, Roayaei Ardakani M, Enayatizamir N, Rodriguez-Couto S. 2012. The Determination of Assay for Laccase of Bacillus subtilis WPI with Two Classes of Chemical Compounds as Substrates. Indian J Microbiol. 52(4):701-707. http://dx.doi.org/10.1007/s12088-012-0298-3
2.
Ride J. 1980. The effect of induced lignification on the resistance of wheat cell walls to fungal degradation. Physiological Plant Pathology. 16(2):187-196. http://dx.doi.org/10.1016/0048-4059(80)90033-8