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溶菌酶的酶学测定(EC 3.2.1.17)

描述

本程序步骤可用于溶菌酶产物的酶学测定。分光光度速率测定(A450,光程 = 1 cm)基于以下反应:

Lysozyme

溶壁微球菌细胞(完整) ––––––––> 溶壁微球菌细胞(已溶解)

单位定义 — 一个单位的溶菌酶在pH6.24、25℃下,使用溶壁微球菌悬液作为底物,在2.6 mL反应混合物中每分钟产生0.001 ΔA450

所需试剂和设备

1.0 M磷酸氢钾溶液(P8709)

1.0 M磷酸氢二钾溶液(P8584)

1 M 氢氧化钾(KOH)溶液

1 M HCl溶液

溶壁微球菌,ATCC号4698,冻干细胞(M3770)

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书,获取危害和安全操作方法相关信息。

制备说明

使用超纯水(25 °C时≥18 MΩxcm电阻率)制备试剂。

缓冲液(50 mM磷酸钾缓冲液,pH 6.24,25°C)— 制备550 mL:

  • 加入20.125 mL的1.0 M磷酸氢钾溶液(P8709)。
  • 加入7.375 mL的1.0 M磷酸氢二钾溶液(P8584)。
  • 加入超纯水,最终定容为550 mL。
  • 使用1 M KOH或1 M HCl在25°C下将pH调节至6.24。

底物悬液(0.015% [w/v] 溶壁微球菌细胞悬液)— 使用溶壁微球菌,ATCC号4698,冻干细胞(M3770)在缓冲液中制备0.15mg/mL悬液。

底物适用性:该悬液的A450必须介于0.6-0.7之间,而不是缓冲液空白。如有必要,使用适量的缓冲液或溶壁微球菌细胞调整吸光度。

酶溶液(溶菌酶) — 在使用前,立即在冷的(2-8℃)缓冲液中制备含有200-400单位/mL溶菌酶的溶液。

操作流程

1.将以下试剂移液到合适的比色皿中并平衡至25 °C,使用适当恒温的分光光度计:

2.然后添加:

3.立即颠倒混匀并记录A450的下降~5分钟。获得所有测试和空白样的最大线性速率(ΔA450/分钟),使用至少一分钟的时间间隔和最少4个数据点。

结果

计算

1.

lysozyme-eq1

式中:

df =稀释因子

0.001 = 单位定义中的吸光度(ΔA450)变化

0.1 = 酶溶液的体积(以毫升计)

2.

lysozyme-eq2
材料
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参考文献

1.
Shugar D. 1952. The measurement of lysozyme activity and the ultra-violet inactivation of lysozyme. Biochimica et Biophysica Acta. 8302-309. http://dx.doi.org/10.1016/0006-3002(52)90045-0

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