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变溶菌素的酶促检测

描述

该操作步骤可用于变溶菌素产物。连续分光光度法测定(A600,光路= 1 cm)是基于以下反应:

变溶菌素
粪链球菌 细胞壁(不可溶) -------------------> 可溶产物

单位定义:以粪链球菌细胞壁混悬液为底物,在1 mL体积中,1单位变溶菌素在pH 6.0、37 °C条件下每分钟可产生0.01的ΔA600

所需试剂和设备

MES水合物 (货号M8250)
1.0 M氯化镁溶液 (货号M1028) TES (货号T1375) 变溶菌素测定底物 (货号M3440)

制备说明

使用超纯水(25 °C时≥18 MΩxcm电阻率)制备试剂。

缓冲液(50 mM MES缓冲液,含1mM氯化镁,在37 °C时pH 6.0)— 将1.95克MES水合物 (货号M8250) 溶于190 mL超纯水中,然后加入0.2 mL的1.0 M氯化镁溶液 (货号M1028)。在37 °C条件下,使用1 M NaOH调整pH至6.0,然后使用超纯水将溶液总体积调整至200 mL。

酶稀释液(50 mM TES,含1 mM氯化镁,在37 °C时pH 7.0)— 将2.29克TES (货号T1375)溶于190 mL超纯水中,然后加入0.2 mL的1.0 M氯化镁溶液 (货号M1028)。在37 °C条件下,使用1 M NaOH调整pH至7.0,然后使用超纯水将溶液总体积调整至200 mL。

底物(粪链球菌细胞壁混悬液)— 使用约10 mL缓冲液制备对数期粪链球菌STF-3 (ATCC® 12784)细胞的细胞壁混悬液,其浓度应使A600在0.48-0.52范围内。或者,可根据产品数据表中的说明制备变溶菌素检测底物 (货号M3440) 。

酶溶液(变溶菌素)— 在使用前,使用预冷的(2–8 °C) 酶稀释剂制备含500–700单位/mL变溶菌素的溶液。

操作流程

在3.04 mL反应混合物中,终浓度为49 mM MES、1 mM MgCl2、0.66 mM TES和6.5–9.2单位的变溶菌素。

1.用移液器将底物转移至合适的比色皿中。

2.在37 °C平衡并使用适当的恒温分光光度计监测A600,直至恒定。 然后添加:

3.立即颠倒混匀并记录A600的下降~10分钟。此过程持续长达1分钟,最少4个数据点,利用测试品和空白品的最大线性率获得ΔA600/分钟。

结果

计算

1.

式中:
3.04 = 反应混合物体积(mL)
df = 稀释系数 0.01 = 每单位每分钟的吸光度降低值 0.04 = 所用酶溶液的体积(mL)

2.

材料
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参考文献

1.
Calandra G, Cole R. 1980. Lysis and protoplast formation of group B streptococci by mutanolysin. Infection and Immunity. 28,1033-1037.