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主页酶活性测定果胶酶的酶促检测

果胶酶的酶促检测

1.目标

建立果胶酶酶促测定的标准化操作流程。

2.适用范围

本操作流程适用于货号P4716、P0690、P2401和P4300的产品。

3.定义

3.1 纯水=来自去离子系统的水,25ºC条件下电阻率>或= 18MΩ•cm

3.2 单位定义= 在pH 4.0、25 ℃条件下,一单位每小时可从聚半乳糖醛酸中解离1.0微摩尔的半乳糖醛酸。

4.讨论

聚半乳糖醛酸+ H2O 果胶酶 > 半乳糖醛酸
多聚半乳糖醛酸 + I2 > 氧化产物
2Na2S2O3+ I2 > 2NaI + Na2S4O6
用硫代硫酸钠滴定过量的碘。

5.责任

分析服务实验室人员应遵循本书面操作流程。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项,请参阅材料安全数据手册(MSDS)。

7.操作流程

7.1 条件:

T = 25 °C, pH = 4.0

7.2 方法:
滴定终止反应

7.3 试剂:

7.3.1
0.5%(w/v)聚半乳糖醛酸(Sub)

7.3.1.1
向1.00 g至1.05 g聚半乳糖醛酸(货号P3889)中 加入200 mL纯水,搅拌配制溶液。

7.3.1.2
一边搅拌一边煮沸,保持沸腾五分钟整。立即放入带有浸入式搅拌器的25 ºC水浴中。搅拌至温度25 ℃恒定后,再搅拌溶液10分钟。

7.3.1.3
一边继续搅拌,一边加入0.05 mL试剂7.3.6(NaOH-2)的等分试样以调节溶液的pH值,加入间隔为1分钟,直至pH 4.0。在搅拌条件下加入0.05 mL等份的2N NaOH,直至pH保持在4.00至4.05至少10分钟。如果存在颗粒,则需通过Evergreen柱进行过滤,筛板直径最大为90 μM。

7.3.1.4
重新检查pH值,在25 ℃条件下,使用试剂7.3.3 (NaOH)边搅拌边调节pH至4.00-4.02。pH应保持在4.00-4.02的范围内至少30分钟。

7.3.1.5
可能需要每15分钟重新检查一次pH值,以确保在25 ºC时pH值在4.00到4.02范围内。如果不在此范围内,使用0.1N NaOH对pH进行调节。

7.3.2
100 mM 碘(I2)
使用碘定量滴定标准品,0.1 N(货号318981)。

7.3.3
1.0 N氢氧化钠(NaOH)溶液(货号S2770)

7.3.4
1 M碳酸钠(Na2CO3
利用纯水和碳酸钠(试剂级,货号S2127)配制106 mgs/mL的溶液。

7.3.5
2.0 N硫酸(H2SO4)
利用纯水和硫酸(ACS试剂级,货号258105)配制0.06 mL/mL的溶液。

7.3.6
10 N氢氧化钠(NaOH-2)
利用纯水和氢氧化钠(试剂级,货号S5881)配制400 mgs/mL的溶液。

7.3.7
100 mM硫代硫酸钠,标准化 (Na2S2O3)
利用3L纯水、78.3 g硫代硫酸钠五水合物(货号S8503)和0.6 g碳酸钠一水合物(货号S4132)配制溶液。使用重铬酸钾(NIST)制备的重铬酸钾标准溶液进行标准化。

7.3.8
果胶酶溶液(酶)
临使用前,利用低温纯水配制约100单位/ mL的溶液。可能需要摇晃一分钟以上加速溶解,同时仍可能存在一些不溶性微粒。

7.3.9
1.0%(w/v)淀粉(淀粉)
在纯水中搅拌并煮沸5分钟整,配制10 mgs/mL的溶液。冷却至室温。使用可溶性土豆淀粉(货号S2004)。

7.4 测定方法

7.4.1
将以下试剂(mL)加入适宜的玻璃容器中,对照和/或样品组各一式三份:

7.4.2 旋转混匀,平衡至25 ℃至少3分钟。然后添加:

7.4.3 旋转混合并在25 ºC下孵育试样和空白样5分钟整。然后添加以下内容物:

7.4.4 旋转混匀,在黑暗条件下放置20.0分钟整。然后添加:

7.4.5 通过旋转混合,并室温放至于搅拌器上。用试剂7.3.7 (Na2S2O3) 滴定至溶液呈淡黄色。然后添加以下内容物:

7.4.6 搅拌后,继续用试剂7.3.7 (Na2S2O3)滴定至溶液无色。以毫升为单位记录用量。

7.5 计算

式中:
df =稀释系数
1 = 1微摩尔半乳糖醛酸被1等微摩尔量的I2氧化 100 = 每毫升滴定剂等微摩尔量的S2O3
0.100 = 酶促反应所用的酶体积(mL)
2 = 每等微摩尔量还原 I2 的等微摩尔量的氧化S2O3 5.0 = 每定义单位所需的检测孵育时间(min)

7.6 检测体系终浓度
在5.0 mL反应混合物中,终浓度下含0.49%(w/v)聚半乳糖醛酸和10单位的果胶酶。

8.参考文献

1.
Kertesz Z. 1955. Methods in Enzymology. 1162-164.
材料
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