Merck
主页酶活性测定过氧化物酶的酶学测定(EC 1.11.1.7)

过氧化物酶的酶学测定(EC 1.11.1.7)

描述

该实验程序用于使用连苯三酚作为底物测定过氧化物酶的酶活性。使用该方法的产品包括但不限于:P1709、P2088、P6140、P6782、P8125、P8170、P8250、P8375、P8415和P8651。

连续分光光度法测定(A420,光路= 1 cm)是基于以下反应:

单位定义:一个单位的过氧化物酶在pH 6.0、20 ℃下,在20秒钟内从连苯三酚形成1.0毫克红陪酚。该单位等同于在25 °C每分钟~18 µM单位。

注意事项

有关危险和安全处理方法的信息,请参阅材料安全数据表。

所需试剂和设备

1.0 M磷酸氢钾溶液(P8709)

1.0 M磷酸氢二钾溶液(P8584)

过氧化氢,30% (w/w) 溶液(H1009)

连苯三酚(254002)

比色皿和恒温分光光度计

制备说明(存储 / 稳定性)

使用超纯水(25 °C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率)制备试剂。

磷酸盐缓冲液(100 mM磷酸钾缓冲液,pH 6.0,20°C)— 加入17.36 mL的1.0 M磷酸氢钾溶液(P8709)。加入2.64 mL的1.0 M磷酸氢二钾溶液(P8584)并用超纯水定容至200 mL。用1 N KOH或1 N HCl在20℃下调节至pH 6.0。将磷酸盐缓冲液储存在冰上。

过氧化物溶液(0.50% [w/w] 过氧化氢[H2O2] 溶液)— 使用过氧化氢,30% (w/w) 溶液(H1009)在超纯水中制备1:60稀释液。

注意:制备新鲜稀释液用于对照和样品,并将溶液储存在加盖的4打兰小管中,置于冰上,避免暴露于空气。

连苯三酚溶液(5% [w/v] 连苯三酚溶液)— 用连苯三酚(254002)和超纯水在琥珀色(或用铝箔包裹的)小管中制备50 mg/mL溶液。

注意:现配现用,并将此溶液避光保存在冰上。

过氧化物酶溶液 — 在冷的磷酸盐缓冲液中制备10 mg/mL过氧化物酶溶液。在冷的磷酸盐缓冲液中制备含有0.45-0.75单位/mL过氧化物酶的工作溶液,现配现用。

注意:10 mg/mL原液可用于RZ因子测定。

操作流程

最终测定浓度 — 在3.00 mL反应混合物中,最终浓度为14 mM磷酸钾,0.027%(v/v)过氧化氢,0.5%(w/v)连苯三酚,和0.45-0.75单位过氧化物酶。

注意:一次只运行一个比色皿,因为最大速率出现在第一分钟。

1.移取以下试剂到合适的比色皿中:

2.倒置混合,并在适当恒温的分光光度计中平衡至20 ℃约10分钟。

注意所有比色皿可同时孵育,但一次只读取一个比色皿。

3.然后添加:

4.立即通过倒置混合,并记录3分钟内的A420增量。对于所有测试和空白样,使用最大线性速率或0.5分钟间隔获取DA420/20秒。

适用性标准:DA420/20秒比率应在0.18-0.34之间。必要时可对酶浓度进行修改。

结果

计算

1.

式中:
3 = 测定的体积(以毫升计)
df = 稀释因子 12.0 = 1 mg/ml红陪酚在420 nm处的消光系数(内部测定) 0.1 = 使用的酶体积(以毫升计)

2.

3.

材料
Loading

参考文献

1.
Chance B, Maehly A. 1955. Methods in Enzymology. 2, 773-775. Elsevier.
2.
Shannon L, Kay E, Lew J. 1966. Peroxidase isozymes from horseradish roots.I. Isolation and physical properties.. The Journal of Biological Chemistry.. 241(9):2166-2172..

04/17-1