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主页酶活性测定植酸酶的酶促检测(EC 3.1.3.8)

植酸酶的酶促检测(EC 3.1.3.8)

文档记录

源自操作步骤SSPHYT02。包括模板根据现行SOP规范更新和整合注意事项到操作步骤。参阅SOP-DEK-ENZ18。

1.目标

该程序的目的在于测定植酸酶(货号 P9792)的活性。

2.适用范围

本操作步骤的适用范围包括以下反应:
植酸 + H2O 植酸酶 > p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP + Pi

3.定义

3.1. 纯水 - 来自去离子系统的水,电阻率>或= 18MΩcm @ 25 °C。

3.2. p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP = p-肌-肌醇 1,2,4,5,6- 五磷酸

3.3. 植酸 = 肌-肌醇六(二氢磷酸)

3.4. Pi = 无机磷酸盐

3.5. 植酸酶的单位定义 = 在pH 2.5、37 °C下,一个单位每分钟将从4.2 X 10-2 M植酸中释放1.0 μmol无机磷酸。

4.讨论

4.1. 植酸 + H2O 植酸酶 > p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP + Pi

4.2. 方法 = 比色测定,温度 (T) = 37°C,pH = 2.5,A400nm,光程 = 1cm

5.责任

我们所有工作人员都有责任遵循本书面操作规程。

6.安全

测定开始之前,请参阅每种化学品的MSDS。

7.操作流程

7.1 试剂

7.1.1 200 mM甘氨酸缓冲液,pH 2.8、37 °C(缓冲液)

7.1.1.1. 配制100 mL,用纯水溶解甘氨酸,盐酸,货号G7126。

7.1.1.2. 用1 M NaOH或1 M HCl将pH在37 °C下调至2.5。

7.1.2. 44.1 mM植酸溶液,pH 2.5、37 °C(植酸)

7.1.2.1. 配制 10 mL,试剂7.1.1溶解植酸,二钾盐,货号P5681。

7.1.2.2. 用1M HCl将pH在37 °C下调至2.5。

7.1.3. 5% (w/v) 钼酸铵溶液(Amm Moly)
配制100 mL,纯水溶解钼酸,四水铵盐,货号M0878。

7.1.4 5N 硫酸溶液
配制 100 mL,纯水溶解硫酸,95-98%,A.C.S.试剂,货号258105。

7.1.5 丙酮
使用丙酮,A.C.S.试剂级,货号179124。

7.1.6 显色剂 (CRS)

7.1.6.1 配制100 mL,25 ml试剂7.1.3加入到25 mL试剂7.1.4和50 mL试剂7.1.5。

7.1.6.2 混匀并立即使用。

7.1.6.3 新鲜配制。

7.1.7 50 mM磷酸钾溶液 (P Std.)
配制10 mL,用去离子水溶解磷酸钾,一元,无水,货号P5379。

7.1.8 植酸酶溶液(酶)
现用现配,用低温试剂7.1.1配制包含0.5-2.0单位/mL植酸酶的溶液。

7.2. 步骤——空白/试样制备

7.2.1. 将下列试剂移液转入(按ml)一个4 dram小瓶(vial):

7.2.2. 平衡到37 °C,然后添加:

7.2.3. 立即倒置混匀并在37 °C下孵育整整30min。然后添加:

7.2.4. 涡旋混匀,然后将溶液转移到适宜的容器中,使用适宜的分光光度计记录试样和空白样的A400nm

7.3. 步骤-标准曲线:

7.3.1 将下列试剂移液转入(按ml)适宜的容器中:

7.3.2 涡旋混匀并在37 °C下孵育30分钟。然后添加:

7.3.3 涡旋混匀,然后将溶液转移到合适的比色皿中,使用适宜的分光光度计记录标准样和标准空白样的A400nm

7.4. 计算

7.4.1 标准曲线

7.4.1.1 ΔA400nm标准样 = A400nm标准样 - A400nm标准空白样

7.4.1.2 绘制ΔA400nm相对磷酸μmol量的标准曲线。

7.4.2 样品测定

7.4.2.1 ΔA400nm试样 = A400nm试样 - A400nm空白试样

7.4.2.2 使用标准曲线测定释放磷酸的μmol量。

7.5.2.3单位/ml酶 = (释放磷酸的µmol量)(df)
(30)(0.025)

式中:
df = 稀释因子
30 = 每定义单位的检测时间(分钟) 0.025 = 所用酶的容积(ml)

7.4.2.4单位/mg固体 =单位/ml酶
Mg固体/mL酶

8.参考文献和附件

1.
Heinonen, J, Lahti R. 1981. Analytical Biochemistry. 113313-317.

9审批

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材料
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