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主页酶活性测定β-NAD和β-NADH的回收微量分析

β-NAD和β-NADH的回收微量分析

1.目的

建立β-NAD和β-NADH的回收微量分析的标准化操作流程。

2.范围

本操作流程适用于对β-NAD和β-NADH进行回收微量分析的所有产品。

3.定义

纯水 – 来自去离子系统的水,电阻率>或=18MΩ•cm @25 ºC

β-NADH = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,还原形式

β-NAD = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,氧化形式

MTT = (3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑)

PES =吩嗪乙基硫酸盐

4.讨论

β - NAD + 乙醇 乙醇脱氢酶 > β-NADH + 乙醛
β-NADH + MTT + PES → 显色染料 + β - NAD

5.责任

分析服务人员应遵循本书面实验方案。

6.安全

有关危险因素及合适的操作注意事项,参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1.条件:PH = 7.8,T = 25 °C,A570 nm,光程 = 1 cm

7.2.方法:连续光谱法速率测定

7.3.试剂:

7.3.1. 1 M二甘氨酸(货号B3876)
采用纯水配制成163.2 mg/mL溶液。可能需要涡旋加速溶解。须现配现用。

7.3.2. 200 proof乙醇 (货号459828)

7.3.3. 0.1 M 乙二胺四乙酸(EDTA)
采用纯水和乙二胺四乙酸四钠水合物(货号ED4SS)配制41.6 mg/mL的溶液。可能需要涡旋加速溶解。

7.3.4. 20 M吩嗪乙基硫酸盐(PES;货号P4544)
采用纯水配制成6.7 mg/mL的吩嗪乙基硫酸盐溶液。可能需要涡旋加速溶解。须现用现配并存放在冰上。此试剂会快速降解,因此请在溶解后两小时内使用。

7.3.5. 10 mM (3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)
采用纯水和(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑(货号M2128)配制成4.1 mg/mL的溶液。可能需要涡旋和/或超声处理加速溶解。实验期间试剂须遮光室温保存。

7.3.6. 0.045 mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,氧化形式(β-NAD)
利用低温纯水和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(货号N1636)配制成0.045 mM的溶液。校正特定批次的水含量。请使用A类容积式玻璃容器。可能需要超声处理加速溶解。此试剂应现配现用。

7.3.7. 待测溶液(试样)
利用低温纯水配制待测溶液,等待Δ A570nm/min ≤ 0.1的情况持续5分钟时间窗。此反应主要采用乙醇脱氢酶(ADH)进行。对于ADH,蛋白浓度通常为1-10 mg/mL之间。

7.3.8. 120 mM二甘氨酸,3.7% ETOH,5 mM EDTA(RC)
在A类定容玻璃容器中,通过混合以下成分(ml)配制反应混合物:

在25 °C下,采用1 M 氢氧化钠(货号S2567)或1 M盐酸(货号H3162)将pH调节为7.8。

7.4.操作流程

7.4.1. 采用适宜的恒温分光光度计,在25 °C下按照下表所列的具体顺序,依次将以下成分加入到适宜的反应容器中。试剂7.3.4、试剂7.3.5和试剂7.3.6应尽可能依次快速加入。可能需要进行多次浓度测试。

立即倒置混匀,并记录6分钟内的A570nm增量。获取5分钟时间窗内的所有水平的Δ A570nm/min。

7.5. 计算

7.5.1. 标准曲线:
校正后的标准样A570nm/min = (标准样ΔA570nm/min – 空白样ΔA570nm/min – 试样ΔA570nm/min)

其中:试样ΔA570nm/min为7.5.2中测定的所有试样校正后的ΔA570nm/min平均值。
分别采用校正后的标准样Δ A570nm/min以及标准样中的β-NAD/反应混合物纳摩尔数作图,测定直线的斜率、Y轴截距以及相关系数值。相关系数值应达到0.99以上。

7.5.2. 试样测定:
校正后的试样ΔA570nm/min = (试样ΔA570nm/min – 空白样ΔA570nm/min)
使用标注曲线并对90%一致性试样结果求平均,确定β-NAD/试样的纳摩尔数。

0.100 = 反应混合物中使用的试剂7.3.7(试样)体积(ml)
10.0 = 试剂7.3.7(试样)浓度(mg固体/mL)
mg蛋白/mg固体 = 基于E1% 、280 nm的蛋白测定结果。
1,000,000 = 从mg至ng的换算系数
分子量 =试剂7.3.7(试样)分子量。马肝脏来源乙醇脱氢酶的分子量等于160,000,面包酵母来源乙醇脱氢酶的分子量等于 141,000。

7.5.3. 货号A3263参数适于回收微量分析β-NAD和β-NADH。适用于标准依据如下条件确定:由于A7011已经结合β-NAD和β-NADH、A3263理应少量结合β-NAD和β-NADH,如果β-NAD/ADH的摩尔比低于A7011中的β-NAD/ADH平均摩尔比的1/10,则视为A3263适用。

材料
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