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酶法测定尿素(苯丙氨酸测定)

简介

该测定方案适于使用尿素分析试剂盒(MAK006)通过比色检测细胞和组织培养上清液、尿液、血浆、血清和其他生物样品中的尿素含量。尿素浓度通过偶联酶测定法进行测定,其能够产生与样品中存在的尿素成比例的比色(570nm)产物。此测定的线性检测范围为1.0-5.0 nmole。

试剂

尿素测定缓冲液
(MAK006A)
25 mL
溶于DMSO中的过氧化物底物
(MAK006B)
0.2 mL
酶混合物
(MAK006C)
1 vl
显色剂
(MAK006D)
1 vl
转换酶
(MAK006E)
1 vl
尿素标准品,100 mM
(MAK006F)
0.1 mL


需自备的试剂和设备

96孔平底板 – 建议使用透明比色测定板(货号 M4436 或等效产品)。

分光光度计多孔酶标仪

制备说明

样品瓶启封之前,短暂离心。使用超纯水制备试剂。为维持试剂的完整性,请避免反复冷融循环。

尿素测定缓冲液 - 使用前让缓冲液平衡至室温。

过氧化物酶底物 - 使用前在室温下解冻至熔化的溶液。分装并在-20°C下避光和防潮储存。

酶混合物、显色剂和转化酶 - 使用220 μL尿素测定缓冲液分别进行重溶。使用移液枪进行充分混合,然后等分并在避光,-20°C条件下储存。重溶后溶液请在2个月内使用,并在使用时保持冷藏。

储存/稳定性

本试剂盒在湿冰上运输。建议–20°C避光储存。

操作流程

所有样品和标准品应一式两份运行。

用于比色检测的尿素标准品

用995 μL尿素测定缓冲液稀释5 μL 100mM(100 nmole/μL)的尿素标准溶液,以制备0.5 mM(0.5 nmole /μL)的标准品溶液。将0、2、4、6、8和10μL的0.5mM尿素标准溶液加入至96孔板中,以设置0(空白)、1、2、3、4和5nmole /孔的标准品。向每个孔中加入尿素测定缓冲液,使终体积达到50μL。

样品制备

组织(20 mg)或细胞(2×106)应在100 μL冰尿素测定缓冲液中进行快速匀浆。在4°C下13,000 x g离心10分钟,除去不溶物。

血清和其他液体样品可以直接添加到孔中。

添加尿素测定缓冲液至样品中以达到终体积为50μL。

对于未知样品,建议测试几份样品稀释液,确保读数在标准曲线的线性范围内。

样品中存在的铵离子、NAD+/NADP+、和丙酮酸会产生背景信号。为了控制产生的背景信号,请通过省略反应混合物中的转换酶,为每个样品设置空白样品。

检测反应

1. 根据表1中的方案准备反应混合物。每个反应(孔)需要50μL对应反应混合物。

表1.反应混合物

2. 向每个孔中添加50μL对应反应混合物。使用水平振荡器或通过移液枪充分混合,并在37℃下孵育反应60分钟。在孵育期间需保证避光。

3. 测定在570 nm处的吸光度(A570)。

结果

计算

将0(空白)尿素标准品获得的吸光值设定为该测定的背景值。通过从所有读数中减去0(空白样)值,可校正背景影响。背景值可能很高,必须从所有读数中减去。使用从适当的尿素标准品所获得的吸光值绘制标准曲线。

注意:每次运行测定方案时,都必须绘制新标准曲线。

从样品读数中减去空白样品吸光值以获得校正后的测量值。使用校正后的测量值,可以从标准曲线中确定样品中存在的尿素含量。

尿素浓度

Sa/Sv = C

Sa = 来自标准曲线的未知样品中的苯丙氨酸量(nmole)
Sv = 加入板孔中的样品体积(μL)
C = 样品中尿素的浓度

尿素分子量:60.07g/mole。

样品计算

尿素量 (Sa) = 4.84 nmole
(来自标准曲线) 样品体积(Sv) = 50 µL 样品中尿素的浓度 4.84 nmole/50 µL = 0.0968 nmole/µL 0.0968 nmole/µL x 60.07 ng/nmole= 5.81 ng/µL

材料
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注意事项和免责声明

本产品仅可用于研发用途,不可用于药物、家用或其他用途。请参阅产品化学品安全技术说明书,获取危害和安全操作方法相关信息。