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流式细胞分析指南

流式细胞分析是一项实验室细胞分析技术。回顾流式细胞分析基本概念、免疫检测方法、流式细胞分析方案主要步骤和适当的对照有助于确保流式细胞分析的准确性。后文提供了一些有助成功开展流实验的要点。

什么是流式细胞分析?

流式细胞分析是一种可根据细胞物理和荧光特性,鉴定和/或分选异质悬浮细胞群的强大技术。这是一种单细胞分析方法,非常适合同时获取大量细胞的单细胞水平定量信息,包括给定类型细胞数目和细胞内特定蛋白含量。

流式细胞分析的部分优势包括快速、可在研究异质细胞群时区分不同细胞亚群的差异,同时支持分析异质性细胞群的亚群。流式细胞分析常用于免疫分型和免疫肿瘤学研究,可分析血液、骨髓和其他样品类型的血液学差异。

流式细胞分析工作原理

流式技术依靠流体动力聚焦技术使细胞悬液样品形成一股单细胞液流,通过激光束。根据细胞对入射光线的散射情况,可每秒数千颗粒的速率,检测细胞大小和胞内复杂情况。随后即将生成的模拟数据转化为数字数据,进行定量和绘图分析。

根据流式细胞测定结果,可确定特定的细胞群和其亚群并通过细胞分选法物理分离,此时会根据细胞的荧光特性控制其电荷大小,从而实现细胞颗粒的静电偏转。如需更精细地鉴定亚群,则要使用探针。贴壁细胞和实体组织成功分离并制成单细胞悬液后,也可采用该技术进行分析。

采用激光激发和检测器进行的常见流式细胞分析示意图。

图 1.常见流式细胞分析示意图。

传统流式细胞仪组件

关于流式细胞分析的最低配置,即使是最基础的单激光流式细胞仪,一般都会配置至少同时检测4种荧光染料的滤光片。目前,单次实验中最多甚至可区分18种波长的光线。

传统流式细胞组件包括:

用于样品处理和细胞分选的液流系统

  • 流动室:样品中的细胞通过流体动力学聚焦并流经激光照射区。

用于荧光检测的光学系统

  • 光通过一系列镜片和滤光片。
  • 根据大小、内部复杂成分和信号强度检测细胞。

用于信号处理、计算机显示和分析的电学系统

  • 光电倍增管将光信号转换为电信号。
  • 信号随后放大和数字化。

流式免疫检测

同其他免疫检测应用一样,流式细胞分析也可通过多种方法利用抗体探测特定的细胞基元。两大最常用方法为:直接检测法和间接检测法。

直接检测法

直接检测法是一种一步染色工艺,通过一抗特异性结合目标抗原,可直接结合支持成像或其他结合状态检测的分子。探测位于细胞表面的抗原时,不建议固定细胞,否则可能导致抗体探针无法接触目标抗原。因此,在数据采集结束前保持细胞活力十分重要。如要查找直接检测法的抗体,可采用我们的Antibody Explorer抗体搜索工具,将Search Within(搜索范围)设为“Primary Antibodies Only”(仅限一抗),application(应用)选择“flow cytometry”(流式细胞分析)。

间接检测法

间接检测法先用纯化抗体与目标抗原孵育结合,再用荧光染料标记的二抗(特异性靶向一抗宿主同型)与一抗特异性结合,形成一抗-荧光二抗复合物。采用纯化一抗搭配各种波长(或颜色)的荧光染料标记二抗(特异性针对生产一抗的宿主同型)可提升抗体库的模块化程度。如要查找间接检测法抗体,可在我们的二抗页面搜索产品列表,筛选“流式细胞分析”应用。

直接和间接检测法流式分析差异。

图 2.直接和间接检测法流式分析对比。

流式细胞分析方案主要步骤

流式细胞分析方案主要分为4个步骤:

  • 样品制备:应通过机械分离方法或化学解离技术制备单细胞悬液,如采用酶溶液或钙螯合试剂。
  • 封闭:通常采用抗Fc抗体稀释液悬浮细胞,防止一抗非特异性结合。
  • 抗体孵育:流式细胞分析的孵育步骤涉及多种组分,包括一抗、二抗、链霉亲和素和荧光染料。
  • 数据采集:大多数流式细胞仪都配备获取和转化细胞特征信号必需的软件。用户可根据自身实验要求设定具体的软件参数。

有关这些步骤的更多内容请参阅流式细胞分析方案主要步骤

适当的对照

除了目标细胞之外,每次进行流式细胞实验还应包含以下对照:

  • 至少一份未染色样品,与试样同时进行每一步的缓冲液孵育,以优化实验的流速和电压。
  • 一份适当的阴性对照样品,与试样基本相同,但用在一抗的宿主种属中生产的同型对照替代试样中的一抗。该对照用于非特异性结合二抗。要查找同型对照,可采用我们的Antibody Explorer抗体搜索工具,在搜索栏输入“isotype control”(同型对照),application(应用)选择“flow cytometry”(流式细胞分析)。
  • 如有需要也可准备一份已知表达所有目标抗原的细胞组成的阳性对照,并与试样共同孵育,但仅用单色检测。