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氨基酸衍生化和GC-MS分析

Katherine K. Stenerson

Reporter US, Volume 25.3

简介

通常使用高效液相色谱(HPLC)来分析氨基酸。但也可使用液相色谱,而且在某些情况下,出于对仪器可用性或者操作成本的考虑,这种方法会是更好的选择。在液相色谱分析之前,需要衍生化氨基酸的极性性质。衍生化旨在使分析物更易挥发、降低反应性,从而改善其色谱行为。针对氨基酸,衍生化用非极性基团取代OH、NH2和SH极性官能团上的活性氢。

甲硅烷基化是一种非常常用的衍生化技术,可用于多种化合物。该方法的主要缺点是其对水分敏感。如果存在水分,可导致反应产量差,衍生化分析物不稳定。在本研究中,我们评估了甲硅烷基化试剂N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA)在氨基酸衍生化中的用途。当与含有活性氢的极性官能团反应时,MTBSTFA形成叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)衍生物:

MTBSTFA结构

图 1.MTBSTFA结构

MTBSTFA衍生物比使用较低分子量试剂 [例如N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)] 形成的那些更稳定且对水分敏感性更低(1)。

实验

将50 μL含有91 μg/mL的L-氨基酸与0.1 N HCl的混合物溶液的等分试样干燥,并加入100 μL纯MTBSTFA,然后加入100μL乙腈。将混合物在100℃下加热4小时。然后用碳酸氢钠中和样品,并在20 m × 0.18 mm I.D. x 0.18μm SLB™-5ms毛细管色谱柱上进行GC-MS分析。

结果

氨基酸TBDMS衍生物的色谱图如图2所示。从尖峰处获得的光谱数据有助于鉴定氨基酸衍生物。用TBDMS基团取代活性氢使分子量增加114。这些衍生物的电子碰撞光谱2含有对应于衍生物分子量减少的典型片段CH3(M-15)、C4H9(M-57)、C4H9 + CO (M-85)、和CO-O-TBDMS (M-159)。图3显示了TBDMS-缬氨酸光谱中这种片段模式的一个例子。

SLB-5ms(28564-U)上氨基酸衍生物的GC-MS分析

图 2.SLB-5ms(28564-U)上氨基酸衍生物的GC-MS分析

缬氨酸TBDMS衍生物的质谱(衍生物的MW = 345)

图 3.缬氨酸TBDMS衍生物的质谱(衍生物的MW = 345)

在所用的反应条件下,大多数氨基酸产生一种衍生物,羟基、胺和巯基上的活性氢(在半胱氨酸的情况下)被TBDMS取代。有些氨基酸产生多种衍生物,特别是天冬酰胺、谷氨酰胺和色氨酸。对于上述氨基酸,反应条件的改变,例如降低温度或改变反应时间,可以防止这种情况发生。例如,将反应时间从2小时增加到4小时,导致完全衍生形式的色氨酸的响应增加。

虽然TBDMS衍生物比传统TMS衍生物更稳定,但其较高的分子量导致GC分析期间的洗脱时间更长。为了平衡这一点,用较短、较细的毛细管柱进行分离。为了保持甘氨酸衍生物峰在溶剂中的分辨率,需要不高于100℃的起始温度。在胱氨酸衍生物洗脱后快速升温至360℃,以确保色谱柱清洁,便于后续分析。

结论

该研究表明,通过适当使用衍生化试剂,如MTBSTFA,可对氨基酸进行GC-MS分析。为实现产生目标衍生物的最大响应,可能需要“调整”反应条件。衍生物可形成特征片段,以便进行MS鉴定。为了减少这些衍生物的总GC分析时间,建议使用较短、较细的柱,例如20 m x 0.18 mm I.D. x 0.18 μm SLB-5ms。

材料
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参考文献

1.
Sobolevsky TG, Revelsky AI, Miller B, Oriedo V, Chernetsova ES, Revelsky IA. 2003. Comparison of silylation and esterification/acylation procedures in GC-MS analysis of amino acids. J. Sep. Science. 26(17):1474-1478. http://dx.doi.org/10.1002/jssc.200301492
2.
Kitson FG, Larsen BS, McEwen CN. Gas Chromatography and Mass Spectrometry, A Practical Guide; Academic Press: San Diego, 1996; Chapter 9..
3.
Molnár-Perl I, Katona Z. 2000. GC-MS of amino acids as their trimethylsilyl/t-butyldimethylsilyl Derivatives: In model solutions III. Chromatographia. 51(1):S228-S236. http://dx.doi.org/10.1007/bf02492811