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主页成像分析和活细胞成像荧光原位杂交(FISH)

荧光原位杂交(FISH)

试剂和设备

  1. 20X 柠檬酸钠缓冲液(SSC:3 M NaCl,0.3 M柠檬酸钠,pH 7或产品货号S6639)
  2. RNase A(产品货号R4642)100 µg/ml于2x SSC中
  3. 胃蛋白酶(产品货号P6887) 40单位/ml于10 mM HCl中
  4. 多聚甲醛,EM级(产品货号P6148)新近解聚的,4% w/v于水中
  5. 乙醇
  6. 标记的探针。通过缺口平移随机引物或聚合酶链反应(如ADVANCE™缺口平移试剂盒)而对质粒DNA进行生物素-11-dUTP标记
  7. 杂交混合液:50%甲酰胺(产品货号F7508)、10%硫酸葡聚糖(产品货号D8906)、0.1% SDS(产品货号L4390)、0.5-1.5 ng/µl标记的探针和300 ng/ml鲑鱼精子DNA(产品货号D7656)于2x SSC中
  8. 洗涤缓冲液:20%甲酰胺(产品货号F7508)于0.1x SSC中
  9. 检测缓冲液:0.2% Tween 20(产品货号P1379)于4x SSC中
  10. 封闭缓冲液:5% 牛白蛋白(产品货号A3803)于检测缓冲液中
  11. 抗体或检测化合物(如链霉亲和素-Cy3,产品货号S6402)于封闭缓冲液中
  12. DAPI(产品货号D9542)2 µg/ml于抗荧光淬灭封片剂中。
  13. 荧光显微镜、滤光片和可选的三带通滤波器(x58,Omega Optics)
  14. 玻片(产品货号S8400)
  15. 用于孵育和杂交步骤的塑料盖玻片(从可高压灭菌的垃圾袋切下,如产品货号B4408)
  16. 热模块/ 改进的热循环仪
  17. 用于洗涤步骤的科普林缸(产品货号S6016、S5641或S5891)

操作流程

玻片制备
杂交
检测

玻片制备

  1. 从任何细胞类型开始染色体制备。
  2. 在37 °C下用200 µL RNase孵育1小时
  3. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
  4. 在10 mM HCl中漂洗玻片。
  5. 在37 °C下用200 µL胃蛋白酶孵育10分钟。
  6. 在去离子H2O中漂洗玻片。
  7. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
  8. 在多聚甲醛中固定玻片10分钟。
  9. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。
  10. 在梯度乙醇中对玻片进行脱水:70%、80%、95%;每种2分钟。
  11. 风干。

杂交

  1. 每块玻片制备30 µl杂交溶液。加热至70 °C,维持10分钟后置于冰上。
  2. 每块玻片上加入30 µl杂交溶液并盖上塑料盖玻片。
  3. 在热模块上65-70 °C条件下对玻片进行变性5分钟。
  4. 逐渐降温至37 °C。
  5. 在湿度箱37 °C条件下杂交过夜。

检测

  1. 在2x SSC中洗涤玻片以去除盖玻片。
  2. 在洗涤缓冲液中40 °C条件下洗涤玻片5分钟。重复。
  3. 在0.1x SSC中40 °C条件下洗涤玻片5-15分钟。
  4. 在2x SSC中40 °C条件下洗涤玻片5-15分钟。
  5. 将玻片冷却至室温。
  6. 在检测缓冲液中平衡玻片5分钟。
  7. 在封闭缓冲液中封闭20-30分钟。
  8. 用50 µl 抗体或检测化合物孵育30-60分钟(如在封闭缓冲液中的5 µg/ml 链霉亲和素-Cy3)。
  9. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复两次。
  10. 用DAPI溶液复染10分钟。
  11. 简短漂洗后在抗荧光淬灭封片剂中进行封片。
  12. 用荧光显微镜进行分析。
材料
Loading
1.
Heslop-Harrison J, Schwazarcher T, Anamthawat-Jónsson K, Leitch AR, Shi M. 1991. In situ hybridization with automated chromosome denaturation. Technique. 3109-15.
2.
Leitch AR. 1994. In situ hybridization : a practical guide. Oxford (England): BIOS Scientific Publishers.
3.
Harris N, Oparka KJ. 1994. Plant Cell Biology: A Practical Approach. Oxford (England): Oxford University Press.