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Cas9-GFP CRISPR质粒在细胞工程中的应用

1.CRISPR设计和特异性

CRISPR核酸内切酶的活性差异很大,即使是在接近基因组的多个CRISPR中也是如此。1 因此,我们强烈建议您测试针对不同DNA序列的3到4种CRISPR核酸酶。 由于CRISPR系统的DNA靶位点的大小明显小于CompoZr® ZFN所需的大小(例如30-36 bp),因此在设计过程中必须小心谨慎,以确保将基因组中其他地方的脱靶效应降至最低。 最近的证据表明, CRISPR核酸内切酶的脱靶是一个值得关注的问题,一些机构正在研发避免脱靶活性的指导操作 5, 8。此外,用于CRISPR设计的许多在线工具也都可用,然而,我们已将特定ZFN设计中的核心功能应用于CRISPR/Cas系统,以在计算机上创建全基因组CRISPR靶序列的集合。 请查看我们的在线CRISPR产品列表为ZFN、CRISPR及相关供体DNA提供最新CRISPR设计套件和定制设计服务。

2.用于细胞培养应用的CRISPR质粒的递送

注意: 除非通过自定义请求指定,否则我们的CRISPR质粒产品将以小规模制备等分试样的形式递送,可能不适合转染到特定的细胞类型中。 为了获得最佳结果,我们建议在转染前使用不含内毒素的DNA纯化试剂盒大规模制备质粒。

ZFN项目的先前经验表明,核转染是一种适用于多种细胞类型的可靠传递方法。 对于在人类细胞中进行的初步实验,我们建议将规模制备的CRISPR质粒DNA核转染入经过良好验证的细胞类型,如K562或U2OS,以评估双链断裂活性或供体整合水平。 这些细胞系已被证明具有高水平的同源重组反应2 ,使其成为检测ZFN和CRISPR核酸酶与新设计的供体构建体相容性的理想选择,然后才转向更具挑战性或未知的细胞类型。 对于小鼠和大鼠细胞培养测试,neuro2A和C6适用于初始CRISPR实验的细胞类型。 剂量实验的一个很好的起点是每0.5 ~ 100万个细胞中含有2-8 μg的CRISPR质粒。

由于我们的单一载体包含一个由GFP连接的Cas9表达盒,在进行基因分型检测或单细胞克隆实验之前,可随后通过显微镜或FACS检测转染的细胞以监测转染效率(图1)。

通过显微镜或FACS监测Cas9-GFP表达盒活性。

图 1.通过显微镜或FACS监测Cas9-GFP表达盒活性。

3.监测CRISPR双链断裂活性

目前已有数种用于监测双链断裂(DSB)活性的公开方案。 最快速、灵活和经济的检测方法是错配切割检测,它可以检测真核细胞中NHEJ活性产生的插入和缺失(位点)的多样性。 最常用的实验方案使用的是CEL-I酶(又称Surveyor核酸酶)6和T7核酸内切酶I(T7EI)。7 如果您的机构有足够的生物信息学和深度测序资源,深度测序也可用于检测和定量CRISPR处理的细胞群中的插入和缺失活性。

如果尽管使用了许多常用CRISPR设计进行尝试但仍无法检测到DSB活性,请考虑为Cas9-GFP表达丰富细胞群,如下一节所述。

4.单细胞克隆和基因分型

由于该产品中的质粒实现了GFP连接的Cas9表达盒,荧光激活细胞分选(FACS)可用于分离Cas9诱导修饰频率显著增加的细胞群(图2)。这种FACS富集方法在递送效率和/或Cas9表达水平低或检测不到的情况下特别有用。此外,GFP共表达方法比替代性报告载体更有优势,包括:

a) Cas9-GFP连接的表达不需要额外的步骤将人工靶位点克隆到替代报告质粒中。
b)转染的dsDNA总量减少。 在许多情况下,某些细胞类型对高剂量的dsDNA敏感,将替代报告质粒形式的额外dsDNA添加到现有的CRISPR和供体载体构建体中可导致细胞毒性。
c)通过Cas9-GFP mRNA、体外转录的gRNA和单链寡核苷酸(ssODN)可以选择使用“不含dsDNA”的方法。

Cas9和GFP蛋白编码区通过编码2A肽的小序列连接。2A肽是一种“自切割”肽,允许从一个转录中产生两个单独的蛋白质,并利用“核糖体跳跃”而不是蛋白水解切割机制产生两个单独的蛋白质。3,14

可根据常用方案收集细胞用于FACS。我们建议将细胞分为低、中、高GFP表达水平的组分。GFP表达最高的细胞群已被证明可以富集基因组编辑,“高”群体的范围为总细胞群的1%至30%。“高”和“中”群体的最佳大小可能会有所不同,这取决于基因组位点、细胞类型、递送方法和其他实验变量。建议将细胞群分成低、中、高三个部分,每个部分占总细胞群的1~20%。

以人KRAS位点为靶点基因座的单一Cas9-GFP载体,通过FACS在人体K562细胞中富集有CRISPR/Cas诱导的CEL-I活性。

图 2.以人KRAS位点为靶点基因座的单一Cas9-GFP载体,通过FACS在人体K562细胞中富集有CRISPR/Cas诱导的CEL-I活性。

5.质粒图谱和特征

质粒图谱和特征

在该载体中实现的Cas9蛋白包含能够产生双链断裂的HNH和RuvC活性。Cas9与Evrogen的TagGFP2荧光蛋白相连。TagGFP2是TagGFP的改良变体,而TagGFP是一种大型多管水母GFP样蛋白的突变体。15,17 TagGFP2拥有明亮的绿色荧光,其激发/发射最大值分别在483和506 nm。2A-GFP编码序列的侧翼是两个HpaI限制性位点,允许去除或替换2A-GFP元素。 XbaI位点可用于线性化载体,以便利用T7 RNA聚合酶通过体外转录产生Cas9-GFP mRNA。

材料
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参考文献

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