缬沙坦中的N-亚硝胺测定
Frank Michel, Analytical & Chromatography Scientific Advisor; Sanjay Poman, Application Expert; Sundaram Palaniswamy, Workflow Solutions Manager
根据美国 FDA 指南进行药品质量控制的 GC-MS 方法
2018 年 7 月，药品监管机构获悉缬沙坦产品中存在亚硝胺杂质（N-亚硝基二甲胺，NDMA，图 1）。1活性药物成分 (API) 缬沙坦是一种血管紧张素-II-受体阻滞剂 。这一成分用于治疗 ACE 抑制剂治疗不耐受患者的高血压、心力衰竭和心脏病发作。2缬沙坦属于一组结构相关的化合物（所谓的沙坦类），共有四唑基团（四个氮和一个碳组成的环） 。后来，其他亚硝胺杂质如 N-亚硝基二乙胺 (NDEA)、N-亚硝基二异丙胺 (NDIPA)、N-亚硝基乙基异丙胺 (NEIPA) 和 N-亚硝基二丁胺 (NDBA) 经证也存在于其他沙坦家族药物及雷尼替丁药物中。随后全球范围召回使用散装缬沙坦原料药的药品，导致市场上缬沙坦类药物暂时短缺。
N-亚硝胺含有亚硝基官能团（-N=O）。根据世界卫生组织 (WHO) 国际癌症研究机构 (IARC) 的报告，大多数亚硝胺对动物具有致癌性和遗传毒性，对人类也可能是致癌物。监管机构和原料药生产商发现，在生产过程中，仲胺或叔胺与亚硝酸盐在酸性条件下反应会形成亚硝胺。沙坦类药物需要亚硝酸钠来形成四唑环，导致形成 N-亚硝胺。亚硝胺也可能由受污染的溶剂、试剂或生产设备引入。3这导致了欧洲药典（Ph.Eur.) 委员会拟定原料药中亚硝胺含量暂定低于1 ppm，并于2020年底降低至30 ppb。4
此类限值范围的测定需要高灵敏度和高选择性的分析技术。大多数方法使用 GC-MS 或 HPLC-MS。5-7这类分析面临的另一个挑战是亚硝胺、API 和配方的多样性，这需要专门定制的杂质检测方法。
这项工作要求根据美国 FDA 指南，制定通过 GC-MS/MS 在 EI MRM 模式测定缬沙坦药品中的 5 种痕量亚硝胺杂质（NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA）的操作步骤。FDA 检测和研究办公室 (OTR) 发布的一种方法奠定了相关方法开发的基础。8方法验证是根据 USP 的要求进行。9
图 1.本研究针对的 N-亚硝胺分子结构
实验
GC-MS/MS 方法使用液体进样，涵盖多种亚硝胺。与 OTR 方法相反，选择了更低膜厚度（0.5 µm 而不是 1 µm）的蜡柱。但这符合 USP 通则 <621> 关于色谱法的规定。10色谱条件以及 MS/MS 条件如表 1 至 3 所示。
| 实验条件 | |
|---|---|
| 色谱柱： | SUPELCOWAX® 10, 30 m x 0.25 mm I.D., 0.5 µm (24284) |
| 柱温箱： | 40 °C (0.5 min)，20 °C/min 至 200 °C，60 °C/min 至 250 °C (3 min) |
| 进样温度： | 250 °C |
| 载气： | 氦气，1.0 mL/min |
| 检测器： | MS/MS（参见表2和表3） |
| 进样体积： | 2 µL – 脉冲不分流进样 |
| 衬套： | 4 毫米单攻丝玻璃棉衬里 |
| 样品稀释液： | INSOLUTION# ALLN，蛋白酶体抑制剂V，1 X 5MG |
| 样品制备： | 使用切丸刀片，将每片药片切成四等分、放入 15 mL 离心管中，然后加入 5 mL 二氯甲烷。将样品涡旋 1 分钟，然后 4000 rpm 离心 2.5 分钟。 使用一次性移液管，将大约 2 mL 二氯甲烷层转移至配有 0.45 µm PVDF 滤膜的 5 mL 注射器中。将约 0.5 mL 样品过滤至 2 mL 小瓶中并盖上盖子。 |
| 标准溶液： | 2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL、80 ng/mL 和 100 ng/mL，用二氯甲烷各自配制 (NDMA/NDEA/NEIPA/NDIPA/NDBA) |
| MS/MS条件 | |
|---|---|
| 调节方式： | 自动调节 |
| 采集方式： | MRM（EI 模式） |
| 喷撞气： | 氦气@1.5 mL/min |
| 淬火气： | 氦气@ 4.0 mL/min |
| 溶剂延迟： | 7 min |
| MS 源温度： | 230 °C |
| 四极管温度： | 150 °C |
| 电子能源： | 70 eV |
| 保留时间： | 50 ms |
| 峰 | 化合物 | 转换 | 保留时间 |
|---|---|---|---|
| 1 | NDMA MRM1 | 74-›44 | 6.952 |
| NDMA MRM2 | 74-›42 | 6.952 | |
| 2 | NDEA MRM1 | 102-›85 | 7.533 |
| NDEA MRM2 | 102-›56 | 7.528 | |
| 3 | NEIPA MRM1 | 116-›99 | 7.784 |
| NEIPA MRM2 | 71-›56 | 7.787 | |
| 4 | NDIPA MRM1 | 130-›42 | 7.971 |
| NDIPA MRM2 | 130-›88 | 7.976 | |
| 5 | NDBA MRM1 | 158-›99 | 9.497 |
| NDBA MRM2 | 84-›56 | 9.494 |
不到 10 分钟即可充分分离五种亚硝胺，并且目标峰与溶剂峰和基质峰很好地分离（图 2）。与 FDA OTR 方法相比，观察到的保留时间较短，可能由于 GC 柱膜厚度较低。
图 2.40 ng/mL 浓度时系统适用性溶液的示例性色谱图。峰标记请参见表 3。
通过对两组转换的多反应监测 (MRM) 实现了低检测限。图 3 显示了两个示例，即最低浓度 2.5 ppb 时 NDEA 和 NDIPA 的色谱图，信噪比超过 10。
图 3.最低浓度 2.5 ppb 时 NDEA（上）和 NDIPA（下）的色谱图。
方法适用性
经验证的 FDA-OTR 方法要求 40 ng/mL 标准品六次重复进样的 % RSD ≤ 5%。使用我们的方法，两个 MRM 下连续六次进样 40 ng/mL 标准品，所有杂质的 % RSD 均小于 5%，如表 4 所示。
| 化合物 | MRM1的% RSD | MRM2的% RSD |
|---|---|---|
| NDMA | 1.8 | 1.3 |
| FDX | 1.1 | 1.1 |
| NEIPA | 4.2 | 1.5 |
| NDIPA | 0.9 | 2.2 |
| NDBA | 4.3 | 3.0 |
此外，线性校准曲线的相关系数(r2)应≥0.998。我们的方法在两种 MRM 下的所有五种亚硝胺均超过了该值（表 5）。
| 杂质 | MRM1 | MRM2 |
|---|---|---|
| NDMA | 0.9994 | 0.9995 |
| FDX | 0.9991 | 0.9995 |
| NEIPA | 0.9995 | 0.9995 |
| NDIPA | 0.9996 | 0.9994 |
| NDBA | 0.9983 | 0.9981 |
缬沙坦药品应用
在当地药房购买的商业缬沙坦产品中添加亚硝胺杂质，浓度达到 10 ppb（NDBA 为 40 ppb）。测定发现亚硝胺的回收率分别在 94.5% 至 105.7% 范围内（表 6）。
| 杂质 | 药品中 10 ppb 含量下的回收率 |
|---|---|
| NDMA | 99.0% |
| FDX | 103.5% |
| NEIPA | 94.5% |
| NDIPA | 103.9% |
| NDBA | 105.7% |
FDA-OTR 方法报告缬沙坦产品亚硝胺测定的定量限 (LOQ) 在 8 – 40 ppb 范围内。我们的方法在缬沙坦药品中达到了更低的 LOQ（表 7）。LOQ 根据化合物信噪比 (S/N) 10下的校准曲线计算，并通过缬沙坦片剂的标准补充实验进行验证。使用信/噪比 (S/N) 3计算检测限 (LOD)。
| 杂质 | 药品的 FDA-OTR LOQ [ppb] | 本研究购买的药品的LOQ [ppb] |
|---|---|---|
| NDMA | 13 | 3 |
| FDX | 8 | 5 |
| NEIPA | 8 | 3 |
| NDIPA | 8 | 5 |
| NDBA | 40 | 32 |
总结
根据 FDA-OTR 建议的方法，可使用 SUPELCOWAX® 色谱柱，通过 GC-MS/MS 在 MRM 模式下轻松测定亚硝胺杂质。所有亚硝胺间以及亚硝胺与溶剂和基质之间均实现良好的峰分离，满足系统适用性要求。该方法成功应用于掺有亚硝胺杂质的缬沙坦药品分析。
产品列表
Network error: Failed to fetch
Network error: Failed to fetch
Network error: Failed to fetch
Network error: Failed to fetch
参考文献
如要继续阅读，请登录或创建帐户。
暂无帐户？
