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缬沙坦中的N-亚硝胺测定

Frank Michel, Analytical & Chromatography Scientific Advisor; Sanjay Poman, Application Expert; Sundaram Palaniswamy, Workflow Solutions Manager

 Article from Analytix Reporter - Issue 11

根据美国 FDA 指南进行药品质量控制的 GC-MS 方法

2018 年 7 月,药品监管机构获悉缬沙坦产品中存在亚硝胺杂质(N-亚硝基二甲胺,NDMA,图 1)。1活性药物成分 (API) 缬沙坦是一种血管紧张素-II-受体阻滞剂 。这一成分用于治疗 ACE 抑制剂治疗不耐受患者的高血压、心力衰竭和心脏病发作。2缬沙坦属于一组结构相关的化合物(所谓的沙坦类),共有四唑基团(四个氮和一个碳组成的环) 。后来,其他亚硝胺杂质如 N-亚硝基二乙胺 (NDEA)、N-亚硝基二异丙胺 (NDIPA)、N-亚硝基乙基异丙胺 (NEIPA) 和 N-亚硝基二丁胺 (NDBA) 经证也存在于其他沙坦家族药物及雷尼替丁药物中。随后全球范围召回使用散装缬沙坦原料药的药品,导致市场上缬沙坦类药物暂时短缺。

N-亚硝胺含有亚硝基官能团(-N=O)。根据世界卫生组织 (WHO) 国际癌症研究机构 (IARC) 的报告,大多数亚硝胺对动物具有致癌性和遗传毒性,对人类也可能是致癌物。监管机构和原料药生产商发现,在生产过程中,仲胺或叔胺与亚硝酸盐在酸性条件下反应会形成亚硝胺。沙坦类药物需要亚硝酸钠来形成四唑环,导致形成 N-亚硝胺。亚硝胺也可能由受污染的溶剂、试剂或生产设备引入。3这导致了欧洲药典(Ph.Eur.) 委员会拟定原料药中亚硝胺含量暂定低于1 ppm,并于2020年底降低至30 ppb。4

此类限值范围的测定需要高灵敏度和高选择性的分析技术。大多数方法使用 GC-MS 或 HPLC-MS。5-7这类分析面临的另一个挑战是亚硝胺、API 和配方的多样性,这需要专门定制的杂质检测方法。

这项工作要求根据美国 FDA 指南,制定通过 GC-MS/MS 在 EI MRM 模式测定缬沙坦药品中的 5 种痕量亚硝胺杂质(NDMA、NDEA、NEIPA、NDIPA 和 NDBA)的操作步骤。FDA 检测和研究办公室 (OTR) 发布的一种方法奠定了相关方法开发的基础。8方法验证是根据 USP 的要求进行。9

本研究针对的 N-亚硝胺分子结构

图 1.本研究针对的 N-亚硝胺分子结构

实验

GC-MS/MS 方法使用液体进样,涵盖多种亚硝胺。与 OTR 方法相反,选择了更低膜厚度(0.5 µm 而不是 1 µm)的蜡柱。但这符合 USP 通则 <621> 关于色谱法的规定。10色谱条件以及 MS/MS 条件如表 13 所示。

表1.色谱条件。
表2.MS/MS条件。
表3.五种不同亚硝胺的 MRM。

不到 10 分钟即可充分分离五种亚硝胺,并且目标峰与溶剂峰和基质峰很好地分离(图 2)。与 FDA OTR 方法相比,观察到的保留时间较短,可能由于 GC 柱膜厚度较低。

40 ng/mL 浓度时系统适用性溶液的示例性色谱图。

图 2.40 ng/mL 浓度时系统适用性溶液的示例性色谱图。峰标记请参见表 3

通过对两组转换的多反应监测 (MRM) 实现了低检测限。图 3 显示了两个示例,即最低浓度 2.5 ppb 时 NDEA 和 NDIPA 的色谱图,信噪比超过 10。

最低浓度 2.5 ppb 时 NDEA(上)和 NDIPA(下)的色谱图。

图 3.最低浓度 2.5 ppb 时 NDEA(上)和 NDIPA(下)的色谱图。

方法适用性

经验证的 FDA-OTR 方法要求 40 ng/mL 标准品六次重复进样的 % RSD ≤ 5%。使用我们的方法,两个 MRM 下连续六次进样 40 ng/mL 标准品,所有杂质的 % RSD 均小于 5%,如表 4 所示。

表4.40 ng/mL 亚硝胺标准品连续六次进样的精密度。

此外,线性校准曲线的相关系数(r2)应≥0.998。我们的方法在两种 MRM 下的所有五种亚硝胺均超过了该值(表 5)。

表5.两种 MRM 下亚硝胺的相关系数 (r2)。

缬沙坦药品应用

在当地药房购买的商业缬沙坦产品中添加亚硝胺杂质,浓度达到 10 ppb(NDBA 为 40 ppb)。测定发现亚硝胺的回收率分别在 94.5% 至 105.7% 范围内(表 6)。

表6.加标药品中亚硝胺的回收率。

FDA-OTR 方法报告缬沙坦产品亚硝胺测定的定量限 (LOQ) 在 8 – 40 ppb 范围内。我们的方法在缬沙坦药品中达到了更低的 LOQ(表 7)。LOQ 根据化合物信噪比 (S/N) 10下的校准曲线计算,并通过缬沙坦片剂的标准补充实验进行验证。使用信/噪比 (S/N) 3计算检测限 (LOD)。

表7.FDA-OTR 方法和我们的方法的药品 LOQ。

总结

根据 FDA-OTR 建议的方法,可使用 SUPELCOWAX® 色谱柱,通过 GC-MS/MS 在 MRM 模式下轻松测定亚硝胺杂质。所有亚硝胺间以及亚硝胺与溶剂和基质之间均实现良好的峰分离,满足系统适用性要求。该方法成功应用于掺有亚硝胺杂质的缬沙坦药品分析。

产品列表

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参考文献

1.
WHO. Information Note Nitrosamine impurities. (accessed Nov. 2021). [Internet]. Available from: https://www.who.int/news/item/20-11-2019-information-note-nitrosamine-impurities
2.
European Medicines Agency (EMA). Notification to the CHMP/EMA Secretariat of a Referral under Article 31 of Directive 2001/83/EC. (accessed Nov. 2021). [Internet]. Available from: www.ema.europa.eu/en/documents/referral/angiotensin-ii-receptor-antagonists-sartans-article-31-referral-notification_en.pdf
3.
EMA. Referral under Article 31 of Directive 2001/83/EC angiotensin-II-receptor antagonists (sartans) containing a tetrazole group. (accessed Nov. 2021). [Internet]. Available from: www.ema.europa.eu/en/documents/variation-report/angiotensin-ii-receptor-antagonists-sartans-article-31-referral-chmp-assessment-report_en.pdf
4.
European Directorate for the Quality of Medicines and HealthCare (EDQM). Ph. Eur. Commission adopts a new general chapter for the analysis of N-nitrosamine impurities, 07.12.2020. (accessed Nov. 2021). [Internet]. Available from: www.edqm.eu/en/news/ph-eur-commission-adopts-new-general-chapter-analysis-n-nitrosamine-impurities
5.
FDA. FDA Updates and Press Announcements on Angiotensin II Receptor Blocker (ARB) Recalls (Valsartan, Losartan, and Irbesartan). (accessed Nov. 2021). [Internet]. Available from: https://www.fda.gov/drugs/drug-safety-and-availability/fda-updates-and-press-announcements-angiotensin-ii-receptor-blocker-arb-recalls-valsartan-losartan
6.
EDQM. Ad-hoc projects of the OMCL Network / Methods for determination of nitrosamines. (accessed Nov. 2021). [Internet]. Available from: www.edqm.eu/en/ad-hoc-projects-omcl-network
7.
Taiwan Food and Drug Administration (TFDA). Analytical Methods. (accessed Nov. 2021). [Internet].
8.
US FDA. Combined Direct Injection N-Nitrosodimethylamine (NDMA), N-Nitrosodiethylamine (NDEA), N-Nitrosoethylisopropylamine (NEIPA), N-Nitrosodiisopropylamine (NDIPA), and N-Nitrosodibutylamine (NDBA) Impurity Assay by GC-MS/MS. (accessed Nov. 2021). [Internet]. Available from: www.fda.gov/media/123409/download
9.
USP General Chapter <1225> Validation of Compendial Procedures, USP43-NF38.
10.
USP General Chapter <621> Chromatography USP43-NF38 .
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