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Auto2D® 全自动双向凝胶电泳仪

双向凝胶电泳工作原理是什么?实验室一般通过SDS-PAGE等单向凝胶电泳技术分离蛋白,但这种方法的蛋白分离能力较低。复杂样品可采用高分辨率的双向凝胶电泳(2-DE),基于蛋白质的等电点和分子量可同时分离成百上千的蛋白质。配合分析软件、免疫检测或质谱分析技术使用情况下,双向凝胶电泳可成为强大的蛋白质鉴定和蛋白质组学分析工具。更多资源和产品信息请见蛋白质电泳和蛋白印迹页面。

 

全自动双向凝胶电泳

人们通常认为双向凝胶电泳难以执行且耗时,且重现性低、操作员人为差异悬殊,需要进行高阶用户培训。Auto2D®系统实现了全自动的双向凝胶电泳。上样后,样品先自动进入第一向凝胶,按等电点分离蛋白。平衡后,第一向凝胶被安置在水平SDS-PAGE凝胶上,开始按分子量分离蛋白。Auto2D®双向电泳仪易于使用,并可在1-2小时内快速获得可重现结果。Auto2D®全自动双向凝胶电泳仪的特点及优势:

  • 易于使用,无需高阶培训
  • 快速工作流程,缩短实验室停机时间
  • 操作员人为差异小,重现性高
  • GMP合规IQ/OQ支持

如何使用Auto2D®电泳仪进行双向凝胶电泳?

Auto2D®双向电泳仪全自动完成双向凝胶电泳(2-DE),不仅简化了蛋白分析,还可突破用户人为差异,获得一致性和重现性更高的结果。Auto2D®系统通过高效设计,将通常需要4-24小时的上样、等电聚焦、平衡和SDS-PAGE工作大幅缩减至短短1-2小时。与市面上其他半自动2-DE系统相比,Auto2D®电泳仪可谓独树一帜。

Auto2D®自动完成的双向凝胶电泳流程及步骤。

图 1.Auto2D®自动完成的双向凝胶电泳流程及步骤。

为何要选择双向双向凝胶电泳?

Auto2D®全自动双向电泳仪有很多应用实例。包括用于癌症和疾病机制研究中的差异蛋白表达分析。该系统还可用于分离纯化蛋白以进行结晶或翻译后修饰分析,以及通过双向免疫印记进行过敏或细胞信号通路研究。

细胞和血浆样品的差异蛋白表达分析。

图 2.左图:培养细胞的差异蛋白表达分析,用于癌症生物标记物研究。绿色表示正常细胞中更高丰度的蛋白。红色表示癌症特有的蛋白质点。黄色表示蛋白表达中的overlap(重合的蛋白质点)。右图:血浆样品的差异蛋白表达分析。

便于下游应用的蛋白分离和分析。

图 3.左图:评估治疗性抗体药物的微异质性。红色三角形指示的是目标抗体点;下面的点是无抗体区。右图:纯化前后的蛋白分析。双向凝胶电泳可用于检查样品是否具有适合晶体和X射线结构分析的均一性。

双向电泳免疫印迹

图 4.面粉提取蛋白(SYPRO Ruby染色剂检测),SDS-PAGE(A),WB:抗小麦醇溶蛋白(gliadin)抗体,SDS-PAGE(B), 叠加,SDS-PAGE(C)。面粉提取蛋白(SYPRO Ruby染色剂检测),箭头表示抗小麦醇溶蛋白抗体检测到的蛋白点(D)。采用抗小麦醇溶蛋白抗体的WB(E),叠加(F)。

生物制药中的HCP残留检测

双向凝胶电泳还适于治疗性蛋白和抗体生物工艺中的宿主细胞残留蛋白(HCP)分析。进行生物制药生产时,宿主细胞蛋白(HCP)的残留杂质会激发患者免疫反应,减低药物疗效。因而监管要求药厂监控并去除HCP,确保其处于安全的低浓度范围内。日本、欧洲和美国药典均发布了生物药品生产中HCP检测方法的开发和验证标准。

这些监管标准要求HCP检测方法必须使用经过严格验证的各种检测组分进行系统性开发。验证抗体组分时,需采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)保证抗体对HCP的全面覆盖率。另外,法规还建议通过2D-PAGE等凝胶电泳方法鉴定校准标准品抗原或多克隆抗体生产用抗原。Auto2D®双向电泳仪无需进行高阶用户培训,方便轻松融入生物工艺流程,满足行业标准。

Auto2D®用于ELISA等免疫检测方法的HCP抗体验证

ELISA是最常用的HCP分析方法。这种免疫检测法依靠多克隆抗体识别各种潜在HCP残留,抗体覆盖率广泛。日本和欧洲药典建议使用双向电泳和蛋白印迹的结合方法(双向蛋白印迹法)评估HCP抗体的覆盖率。美国药典建议使用双向蛋白印迹法或免疫亲和纯化-凝胶电泳法评估抗体覆盖率。

使用Auto2D®系统进行HCP抗体验证。

图 5.在Auto2D®系统上,使用pH 3-10 IEF芯片和12.5% PAGE芯片,对商业来源的20 μg Cy3标记CHO HCP抗原进行双向凝胶电泳分析(A)。然后将蛋白转移到膜上并使用两种不同的抗HCP抗体进行免疫印迹分析(B, C)。数据显示,与HCP抗体2相比,HCP抗体1对HCP蛋白的覆盖范围更广。

Auto2D®系统的高重现性

稳定的重现性对于生物药品的生产和质控至关重要。Auto2D®全自动凝胶电泳系统不仅分析更快、通量更高,而且避免了日常不同操作员开展2D-PAGE和2D-DIGE方法造成的人为差异,提供高重现性的可靠结果。

Auto2D系统的高重现性

图 6.在Auto2D® 系统上,使用pH3-10NL IEF芯片和12.5% PAGE芯片,对0.75 μg市售Cy5标记CHO HCP抗原进行双向凝胶电泳分析。同一样品重复检测3次(A-C)。白点(D)为重合结果。数据说明Auto2D® 系统的双向电泳分析具有高重现性。

Auto2D®系统用于抗原分析

HCP抗原可用于免疫制备ELISA等免疫检测的多克隆抗体。HCP抗原还可用作检测和定量分析的校准标准品。使用非转染空载细胞(null cell)培养物生产工艺专用HCP抗原。这种HCP抗原需要通过分析,获得HCP模式、确认蛋白范围广泛、并证明空载培养物HCP可代表生产用培养物HCP。日本、欧洲和美国药典建议采用SDS-PAGE或双向凝胶电泳法鉴定和分析抗原。美国药典还建议采用双向凝胶电泳法作为监控HCP残留的补充方法。

HCP分析

图 7.使用Auto2D®系统通过双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)分离和分析Cy3标记的未纯化CHO HCP抗原和Cy5标记的蛋白A纯化CHO HCP抗原(A-B)。合并后(C)的红点表示经蛋白A纯化处理后仍然存在的HCP。这些数据说明Auto2D®系统可用于分析纯化后的残余HCP。

Auto2D®系统满足监管要求

Auto2D®系统可帮助您达成生物制药生产中的HCP分析监管要求。全自动系统免除不同操作员的人为日常分析差异,在短短2小时内获取可靠结果。Auto2D®可轻松融入生物工艺流程,缩短实验室停工时间。无需外包,利用内部资源即可完成HCP分析,保护您的知识产权。更多产品和资源信息请见蛋白质电泳和蛋白印迹汇总页面。

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