%丙烯酰胺(w/v)1 | 有效分离范围(bp) |
---|---|
3.5 | 1000-2000 |
5.0 | 80-500 |
8.0 | 60-400 |
12.0 | 40-200 |
15.0 | 25-150 |
20.0 | 6-100 |
1N,N'-亚甲基双丙烯酰胺的含量是丙烯酰胺浓度的1/30。 |
%琼脂糖(w/v) | 线性DNA分子(kb)的有效分离范围 |
---|---|
0.3 | 5-60 |
0.6 | 1-20 |
0.7 | 0.8-10 |
0.9 | 0.5-7 |
1.2 | 0.4-6 |
1.5 | 0.2-3 |
2.0 | 0.1-2 |
琼脂糖浓度(%w/v) | 二甲苯 | 溴酚蓝 |
---|---|---|
0.1-1.5 | 4-5 kb | 400-500 bp |
2.0-3.0(筛分琼脂糖) | 750 bp | 100 bp |
4.0-5.0(筛分琼脂糖) | 125 bp | 25 bp |
问题 | 可能的原因 | 解决方案 |
---|---|---|
微弱或缺失的蛋白条带 | 加样量低于染色剂的检测水平 | 检查A280并增加样品浓度 |
使用更敏感的染色剂(例如银染) | ||
蛋白质没有固定在凝胶中 | 使用同样固定蛋白质的染色剂 | |
使用凝胶固定液 | ||
小肽(<4kda)不固定在凝胶中 | 用5%戊二醛固定凝胶。染色前用水冲洗凝胶移液器吸头 | |
蛋白质被降解 | 检查A280并避免蛋白酶污染 | |
蛋白质跑出凝胶 | 使用较高浓度的PAGE凝胶。推荐凝胶浓度参见预制凝胶,如果大小未知,可使用4-20%凝胶 | |
染色后在凝胶上成膜 | 沉淀考马斯蓝R | 在甲醇中漂洗凝胶15秒,立即回到水中或脱色 |
电泳条带分辨率差 | 蛋白浓度高 | 每蛋白负载10μg或每蛋白提取物100μg |
凝胶的年龄,由于碱催化 | 订购新鲜预制凝胶或浇铸新鲜凝胶 | |
凝胶浓度不当 | 推荐凝胶浓度参见预制凝胶,如果大小未知,可使用4-20%凝胶 | |
电泳条带弥散 | 高盐浓度 | 透析样品,用TCA沉淀蛋白或使用脱盐柱 |
蛋白浓度高 | 每蛋白负载10μg或每蛋白提取物100μg | |
蛋白质聚集 | 样品中加入4-8 M尿素 | |
电压偏高 | 10-15v/cm电泳 | |
孔内蛋白质沉淀 | 疏水蛋白 | 样品中加入4-8 M尿素 |
样品中的白色沉淀 | SDS沉淀 | 可能是由于样品中存在胍盐或钾盐 |
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