[ข้ามไปยังเนื้อหา](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [![Merck](https://www.sigmaaldrich.com/static/logos/purple/merck.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th) สินค้า รถเข็น0 THTH สินค้า [เข้าสู่ระบบ / ลงทะเบียน](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [ค้นหาคำสั่งซื้อ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/order-lookup) [สั่งซื้อด่วน](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/quick-order) รถเข็น0 [หน้าแรก](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th)[การหาลำดับ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/applications/genomics/sequencing)ขั้นตอนและวิธีการเรียงลำดับความโกรธ # ขั้นตอนและวิธีการเรียงลำดับความโกรธ __Section Overview__ - [What is Sanger Sequencing?](https://www.sigmaaldrich.com#what) - [การเรียงลำดับความโกรธทำงานอย่างไร ?](https://www.sigmaaldrich.com#how) - [ขั้นตอนการจัดลำดับความโกรธ](https://www.sigmaaldrich.com#sanger) - [วิธีการอ่านผลการเรียงลำดับความโกรธ](https://www.sigmaaldrich.com#read) - [การเรียงลำดับความโกรธเทียบกับ PCR](https://www.sigmaaldrich.com#sequencing) - [สินค้าที่เกี่ยวข้อง](https://www.sigmaaldrich.com#products) ## [](https://www.sigmaaldrich.com)What is Sanger Sequencing? การเรียงลำดับความโกรธหรือที่เรียกว่า " วิธีการสิ้นสุดของโซ่ " เป็นวิธีการในการกำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ของดีเอ็นเอ วิธีการนี้ได้รับการพัฒนาโดยผู้ได้รับรางวัลโนเบลสองครั้ง Frederick Sanger และเพื่อนร่วมงานของเขาในปี 1977 ดังนั้นจึงเป็นชื่อ ของลำดับ Sanger หากต้องการตรวจสอบโครงสร้างทั่วไปของ DNA โปรดดู __รูปที่ 2__ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)การเรียงลำดับความโกรธทำงานอย่างไร ? การเรียงลำดับความโกรธสามารถดำเนินการด้วยตนเองหรือโดยทั่วไปในรูปแบบอัตโนมัติผ่านทางเครื่องจัดลำดับ (__รูปที่ 1__) แต่ละวิธีจะเป็นไปตามสามขั้นตอนพื้นฐานตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง ![การเรียงลำดับอัตโนมัติของตัวจัดการ](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/sequencing/sanger-sequencing_steps_process_diagram.png "การเรียงลำดับอัตโนมัติของตัวจัดการ") __รูปที่ 1__ขั้นตอนพื้นฐานสามขั้นตอนของการเรียงลำดับความโกรธอัตโนมัติ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)ขั้นตอนการจัดลำดับความโกรธ มีสามขั้นตอนหลักในการจัดลำดับความโกรธ ### 1. ลำดับดีเอ็นเอสำหรับ PCR การเลิกจ้างโซ่ ลำดับดีเอ็นเอของความสนใจจะถูกใช้เป็นแม่แบบสำหรับชนิดพิเศษของ [พีซี](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/routine-amplification) Rcall-termination PCR PCR การเลิกจ้างแบบลูกโซ่ทำงานเหมือนกับ PCR มาตรฐานแต่มีความแตกต่างที่สำคัญอย่างหนึ่งคือการเพิ่มนิวคลีโอไทด์ที่ปรับเปลี่ยนแล้ว (dNTPs) ที่เรียกว่า dideoxyribonucleotides (ddntps) ในขั้นตอนการขยายตัวของ PCR มาตรฐาน DNA polymerase จะเพิ่ม dNTPs ให้กับเส้นใย DNA ที่เพิ่มขึ้นโดยการเร่งปฏิกิริยาการก่อตัวของพันธะฟอสโฟไดเอสเตอร์ระหว่างกลุ่ม 3 '-OH ฟรีของนิวคลีโอไทด์สุดท้ายและ 5 '-phosphate ของ th enext (__รูปที่ 2__) ใน PCR การสิ้นสุดแบบลูกโซ่ผู้ใช้ผสม dNTP ที่มีการสิ้นสุดแบบลูกโซ่ในอัตราส่วนที่ต่ำเข้ากับ dNTP ปกติในปฏิกิริยา PCR ddntps ขาด กลุ่ม 3 '-O ที่จำเป็นสำหรับการ สร้างโพลิเมอร์ฟอสฟอสโฟไดเอสเทอร์ดังนั้นเมื่อดีเอ็นเอพอลิเมอเรสรวม dnTP แบบสุ่มการขยายสิ้นสุดลง ผลของ PCR การเลิกจ้างแบบลูกโซ่คือสำเนาของลำดับดีเอ็นเอที่น่าสนใจของ oligonucleotide นับล้านถึงพันล้านชุดซึ่งถูกยกเลิกด้วยความยาวแบบสุ่ม (n) โดย 5 '-dNTPs   การจัดลำดับความรุนแรงด้วยมือจะมีการสร้างปฏิกิริยา PCR สี่ปฏิกิริยาโดยแต่ละปฏิกิริยาจะมี ddNTP (DdATP, dTTP, dDGTP และ dDCTP) เพียงชนิดเดียว   การจัดลำดับตัวจัดการอัตโนมัติ dddntp ทั้งหมดจะถูกผสมในปฏิกิริยาเดียวและแต่ละ dntps ทั้งสี่จะมีฉลากเรืองแสงที่ไม่ซ้ำกัน ### 2. แยกขนาดโดยเจล Electrophoresis ในขั้นตอนที่สอง oligonucleotides ที่สิ้นสุดด้วยโซ่จะถูกแยกออกจากกันด้วยขนาดผ่านทางอิเล็กโตรโฟเรซิสเจล ในเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสตัวอย่างดีเอ็นเอจะถูกโหลดเข้าไปในปลายด้านหนึ่งของเมทริกซ์เจลและมีการใช้กระแสไฟฟ้าดีเอ็นเอจะมีประจุลบดังนั้น oligonucleotides จะถูกดึงไปทางขั้วบวกที่ด้านตรงข้ามของเจล เนื่องจากชิ้นส่วนดีเอ็นเอทั้งหมดมีประจุต่อหน่วยมวลเท่ากันความเร็วที่ oligonucleotides เคลื่อนที่จะถูกกำหนดตามขนาดเท่านั้น ส่วน A ที่เล็กกว่าคือแรงเสียดทานที่น้อยกว่าจะเกิดขึ้นเมื่อเคลื่อนที่ผ่านเจลและยิ่งเร็วขึ้น ดังนั้น oligonucleotides จะถูกจัดเรียงจากเล็กที่สุดไปใหญ่ที่สุดอ่านเจลจากด้านล่างไปด้านบน ฉัน ยังไม่ได้ จัดลำดับความรุนแรงของสแปงเกอร์, oligonucleotides จากแต่ละปฏิกิริยา PCR ทั้งสี่จะทำงานในช่องที่แยกจากเจลสี่ช่อง ซึ่งจะช่วยให้ผู้ใช้ทราบว่า oligonucleotides ใดที่สอดคล้องกับ ddNTP แต่ละตัว ฉัน ไม่มี การเรียงลำดับความโกรธโดยอัตโนมัติ oligonucleotides ทั้งหมดจะทำงานในอิเล็กโทรโฟเรซิสเจลเส้นเลือดฝอยเดียวภายในเครื่องจัดลำดับ ### 3. การวิเคราะห์เจลและการกำหนดลำดับดีเอ็นเอ ขั้นตอนสุดท้ายก็คือการอ่านเจลเพื่อหาลำดับของดีเอ็นเออินพุต เนื่องจากดีเอ็นเอพอลิเมอเรสสังเคราะห์ดีเอ็นเอในทิศทาง 5 ' ถึง 3 ' โดยเริ่มต้นที่ไพรเมอร์ที่ให้มาเทอร์มินัล ddNTP แต่ละตัวจะสอดคล้องกับนิวคลีโอไทด์เฉพาะในลำดับเดิม (เช่นส่วนที่สั้นที่สุดต้องสิ้นสุดที่นิวคลีโอไทด์แรกจากปลาย 5 ส่วนที่สั้นที่สุดเป็นอันดับสองต้องสิ้นสุดที่นิวเคลียสที่สองจากปลาย 5 ' ฯลฯ) ดังนั้นด้วยการอ่านแถบเจลจากเล็กที่สุดไปใหญ่ที่สุดเราสามารถกำหนดลำดับ 5 ' ถึง 3 ' ของสาย DNA ดั้งเดิม ฉัน nmanual Sanger sequencing ผู้ใช้อ่านทั้งสี่เลนของเจลในครั้งเดียวโดยเลื่อนลงด้านล่างไปด้านบนโดยใช้เลนเพื่อกำหนดรหัสประจำตัวของเทอร์มินัล ddnTP สำหรับแต่ละแบนด์ ตัวอย่างเช่นหากพบแถบด้านล่างในคอลัมน์ที่ตรงกับ ddGTP ชิ้นส่วน PCR ที่เล็กที่สุดจะสิ้นสุดลงด้วย ddGTP และนิวคลีโอไทด์แรกจากปลายปี 5 ของลำดับเดิมจะมีฐาน guanine (G)   การจัดลำดับตัวเปลี่ยนอัตโนมัติคอมพิวเตอร์จะอ่านแต่ละวงของเจลเส้นเลือดฝอยตามลำดับโดยใช้ฟลูออเรสเซนซ์เพื่อเรียกตัวตนของเทอร์มินัล ddNTP แต่ละตัว กล่าวโดยสรุปคือเลเซอร์จะสร้างความตื่นเต้นให้กับแท็กฟลูออเรสเซนต์ในแต่ละแบนด์และคอมพิวเตอร์จะตรวจจับแสงที่ได้ เนื่องจาก ddntp ทั้งสี่ตัวถูกติดป้ายฟลูออเรสเซนต์ที่แตกต่างกันแสงที่ปล่อยออกมาจึงสามารถเชื่อมโยงกับตัวตนของเทอร์มินัล dnTP ได้โดยตรง เอาต์พุตเรียกว่าโครมาโตแกรมซึ่งแสดงยอดฟลูออเรสเซนต์ของนิวคลีโอไทด์แต่ละตัวตามความยาวของดีเอ็นเอเทมเพลต ![แผนผังโครงสร้าง DNA ดีเอ็นเอเป็นโมเลกุลที่ประกอบด้วยสองเส้นที่ขดลวดรอบๆกันและกันเพื่อสร้างเกลียวคู่ แต่ละเส้นประกอบด้วยสตริงของโมเลกุลที่เรียกว่า deoxyribonucleotides (dNTPs)](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/protocols/genomics/sequencing/sanger-sequencing_dna-structure.png "แผนผังโครงสร้าง DNA ดีเอ็นเอเป็นโมเลกุลที่ประกอบด้วยสองเส้นที่ขดลวดรอบๆกันและกันเพื่อสร้างเกลียวคู่ แต่ละเส้นประกอบด้วยสตริงของโมเลกุลที่เรียกว่า deoxyribonucleotides (dNTPs)") __รูปที่ 2__แผนผังโครงสร้าง DNA ดีเอ็นเอเป็นโมเลกุลที่ประกอบด้วยสองเส้นที่ขดลวดรอบๆกันและกันเพื่อสร้างเกลียวคู่ แต่ละเส้นประกอบด้วยสตริงของโมเลกุลที่เรียกว่า deoxyribonucleotides (dNTPs) dNTP แต่ละตัวมีกลุ่มฟอสเฟตกลุ่มน้ำตาลและหนึ่งในสี่ฐานไนโตรเจน \[adenine (A), thymine (T), guanine (G) หรือ cytosine (C)] dNTPs ถูกรัดเข้าด้วยกันในรูปแบบเชิงเส้นโดยพันธะโควาเลนต์ของฟอสฟอสโฟไดเอสเตอร์ระหว่างน้ำตาลของ dNTP หนึ่งและกลุ่มฟอสเฟตของถัดไปรูปแบบน้ำตาลฟอสเฟตซ้ำๆนี้ทำให้เกิดกระดูกสันหลังน้ำตาลฟอสเฟต ฐานไนโตรเจนของสองเส้นที่แยกจากกันจะถูกผูกเข้าด้วยกันโดยพันธะไฮโดรเจนระหว่างฐานเสริมเพื่อสร้างเกลียวดีเอ็นเอสองเกลียว ## [](https://www.sigmaaldrich.com)วิธีการอ่านผลการเรียงลำดับความโกรธ การอ่านผลการจัดลำดับความโกรธอย่างถูกต้องจะขึ้นอยู่กับว่าดีเอ็นเอสองเส้นใดที่น่าสนใจและมีสีรองพื้นอะไรบ้าง ถ้าดีเอ็นเอสองเส้นเป็น A และ B และเกลียว A เป็นสิ่งที่น่าสนใจ แต่สีรองพื้นจะดีกว่าสำหรับเกลียว B ส่วนของเอาต์พุตจะเหมือนกับเกลียว A ในทางกลับกันหากเกลียว A มีความสนใจและสีรองพื้นดีกว่าสำหรับเกลียว A จากนั้นเอาต์พุตจะเหมือนกับเกลียว B ดังนั้นเอาต์พุตจะต้องถูกแปลงกลับไปเป็นเกลียว A ดังนั้นหากลำดับของความสนใจอ่าน "TACG" และไพรเมอร์ที่ดีที่สุดสำหรับสาระที่เอาท์พุทจะเป็น "ATGC" และดังนั้นจึงต้องแปลงกลับไปเป็น "TACG" อย่างไรก็ตามหากไพรเมอร์ดีกว่าสำหรับสาระเสริม ("ATGC") ผลลัพธ์จะเป็น "TACG" ซึ่งเป็นลำดับที่ถูกต้อง ในระยะสั้น, ก่อนที่จะเริ่มต้น, คุณจำเป็นต้องรู้ว่าสิ่งที่คุณกำลังกำหนดเป้าหมายและวิธีการที่คุณจะได้รับมี ! ดังนั้นโปรดจำไว้ว่านี่คือตัวอย่างของตัวอย่างเดิม (TACG -> ATGC -> TACG) หากป้ายชื่อของ dideoxynucleotides เป็น T = สีเหลือง, A = สีชมพู, C = สีน้ำเงินเข้มและ G = สีฟ้าอ่อนคุณจะได้รับลำดับสั้นๆรองพื้น -A, ไพรเมอร์ -ATG, ไพรเมอร์ -ATG และไพรเมอร์ -ATGC เมื่อชิ้นส่วนถูกแยกออกจากกันด้วยอิเล็กโตรโฟเรซิสเลเซอร์จะอ่านชิ้นส่วนตามลำดับความยาว (สีชมพู, สีเหลือง, สีฟ้าอ่อนและสีฟ้าเข้ม) และสร้างโครมาโตแกรม คอมพิวเตอร์จะแปลงตัวอักษรดังนั้นลำดับสุดท้ายคือ TACG ที่ถูกต้อง ## [](https://www.sigmaaldrich.com)การเรียงลำดับความโกรธเทียบกับ PCR การเรียงลำดับความโกรธและ PCR ใช้วัสดุเริ่มต้นที่คล้ายกันและสามารถใช้ร่วมกันได้แต่ไม่สามารถแทนที่กันได้ PCR is used to amplify DNA in its entirety. แม้ว่าชิ้นส่วนที่มีความยาวแตกต่างกันอาจเกิดขึ้นโดยบังเอิญ (เช่น DNA polymerase อาจหลุดออกมา) เป้าหมายคือการทำซ้ำลำดับ DNA ทั้งหมด ด้วยเหตุนี้“ส่วนผสม”คือดีเอ็นเอเป้าหมายนิวคลีโอไทด์ดีเอ็นเอไพรเมอร์และดีเอ็นเอพอลิเมอเรส (โดยเฉพาะโพลิเมอร์ Taq ซึ่งสามารถอยู่รอดได้ในอุณหภูมิสูงที่จำเป็นใน PCR) ในทางกลับกันเป้าหมายของการจัดลำดับความเป็นตัวเปลี่ยนคือการสร้าง DNA ที่มีความยาวเท่าที่จะเป็นไปได้จนถึงความยาวเต็มของ DNA เป้าหมาย นั่นคือเหตุผลที่นอกเหนือจากวัสดุเริ่มต้น PCR จำเป็นต้องใช้ dideoxynucleotides การเรียงลำดับความโกรธและ PCR สามารถนำมารวมกันเมื่อสร้างวัสดุเริ่มต้นสำหรับโปรโตคอลการเรียงลำดับความโกรธ PCR สามารถใช้ในการสร้างสำเนาของดีเอ็นเอจำนวนมากที่จะถูกจัดลำดับ การมีเทมเพลตมากกว่าหนึ่งเทมเพลตที่จะทำงานจากทำให้โปรโตคอลของผู้จัดการมีประสิทธิภาพมากขึ้น หากลำดับเป้าหมายเป็น 1,000 นิวคลีโอไทด์ยาวและมีเพียงหนึ่งสำเนาของแม่แบบก็จะใช้เวลานานกว่าในการสร้างชิ้นส่วนที่ติดแท็ก 1,000 อย่างไรก็ตามหากมีสำเนาของแม่แบบหลายชุดในทางทฤษฎีจะใช้เวลาน้อยลงในการสร้างชิ้นส่วนที่ถูกแท็กทั้ง 1,000 ชิ้น ## สินค้าที่เกี่ยวข้อง ขออภัย เกิดข้อผิดพลาดที่ไม่คาดคิด Response not successful: Received status code 500 __บทความที่เกี่ยวข้อง__ - [กำลังตรวจสอบการแก้ไขยีน CRISPR/Cas9 ที่มีตัวกลาง](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/advanced-gene-editing/validating-crispr-cas9-mediated-gene-editing) - [Amino Acid Codon Wheel](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/sequencing/amino-acid-codon-wheel) - [Ultrapure vs. DEPC Treated Water for Molecular Biology Applications](https://www.sigmaaldrich.com/TH/en/technical-documents/technical-article/genomics/dna-and-rna-purification/nuclease-free-water) - [Water for Next-Generation Sequencing](https://www.sigmaaldrich.com/TH/en/technical-documents/technical-article/genomics/next-gen-sequencing/water-for-next-generation-sequencing) - [MULTI-seq Sample Multiplexing for Single Cell Analysis and Sequencing](https://www.sigmaaldrich.com/TH/en/technical-documents/technical-article/genomics/sequencing/multi-seq-sample-multiplexing-single-cell-analysis-sequencing) - [Ultrapure Water for DNA Sequencing](https://www.sigmaaldrich.com/TH/en/technical-documents/technical-article/genomics/sequencing/water-dna-sequencing) __หมวดหมู่สินค้าที่เกี่ยวข้อง__ - [การคัดกรองทางพันธุกรรม](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/molecular-biology-and-functional-genomics/gene-editing-and-functional-genomics/genetic-screening) - [การแก้ไขยีนและจีโนมิกส์เชิงหน้าที่](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/molecular-biology-and-functional-genomics/gene-editing-and-functional-genomics) - [โปรตีน CRISPR Cas9 และการแก้ไขยีน](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/molecular-biology-and-functional-genomics/gene-editing-and-functional-genomics/crispr-gene-editing) - [โคลนเดี่ยว RNAi](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/molecular-biology-and-functional-genomics/gene-editing-and-functional-genomics/rnai-single-clones) - [ไลบรารี RNAi](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/products/molecular-biology-and-functional-genomics/gene-editing-and-functional-genomics/rnai-libraries) บนสุด __เข้าสู่ระบบเพื่อดำเนินการต่อ__ เพื่ออ่านต่อ โปรดเข้าสู่ระบบหรือสร้างบัญชีใหม่ เข้าสู่ระบบ__ยังไม่มีบัญชีใช่หรือไม่?__ลงทะเบียน หน้านี้ได้ถูกแปลโดยเครื่องแปลภาษาเพื่อความสะดวกของลูกค้าของเรา เราได้พยายามเพื่อให้มั่นใจว่าเครื่องแปลภาษาแปลได้ถูกต้องแม่นยำ อย่างไรก็ตาม เครื่องแปลภาษานั้นไม่สมบูรณ์แบบ หากคุณไม่พอใจกับเนื้อหาที่แปลโดยเครื่องแปลภาษา โปรดอ้างอิงจากฉบับภาษาอังกฤษ An unknown error has occured.