ฟอสฟอรัสโอลิโกโน ucleotides

หลายสายพันธุ์ของกระดูกสันหลังฟอสเฟตได้รับการพัฒนาในความพยายามที่จะเปลี่ยนแปลงคุณสมบัติทางเคมีของดีเอ็นเอของรัฐพื้นเมืองและดังนั้นจึงเอาชนะความท้าทายที่สำคัญสองประการที่เกี่ยวข้องกับการใช้ oligonucleotides ในร่างกายรวมถึง: 1) การจัดส่งไปยังภายในของเซลล์ผ่านเมมเบรนพลาสมาซึ่งเป็นตัวทำให้ไขมันที่ไม่มีโปรตีนในการขนส่งส่วนใหญ่ไม่สามารถซึมผ่านไปยังโมเลกุลของขั้วและ 2 ได้) การขยายอายุการใช้งานของโมเลกุลที่มีประสิทธิภาพโดยการลดการย่อยสลายของนิวไคลีเสริมและภายในเซลล์

หนึ่งในสายพันธุ์ของกระดูกสันหลังที่เป็นต้นฉบับและยังคงใช้กันอย่างแพร่หลายมากที่สุดคือ phosphorothioate ซึ่งโดยทั่วไปเรียกว่า S-oligo เมื่อรวมเข้ากับ oligonucleotide (รูปที่ 1) Phosphorothioate ได้รับการค้นพบเพื่อช่วยบรรเทาความท้าทายที่สำคัญที่สองที่เกี่ยวข้องกับการใช้ oligonucleotides ในร่างกายโดยการลดกิจกรรมของนิวเคลียสพิเศษและภายในเซลล์¹

รูปที่ 1 ฟอสฟอรัสและการเชื่อมโยงระหว่าง phosphodiate phosphothioate น้ำตาล moieties ในรัฐพื้นเมืองดีเอ็นเอ oligonucleotides เชื่อมโยงผ่านฟอสเฟต (รวมถึงออกซิเจนที่ไม่ใช่การเชื่อมโยงไฮไลท์โดยลูกศรสีฟ้า) ในขณะที่น้ำตาล moieties ใน oligonucleotides ปรับเปลี่ยนด้วยน้ำยากำมะถันจะเชื่อมโยงโดย phosphorothioate (รวมถึงกำมะถันที่ไม่ใช่การเชื่อมโยงไฮไลท์โดยลูกศรสีแดง)

คุณสมบัติเหล่านี้ทำให้ phosphorothioate มีประสิทธิภาพในการสร้าง oligonucleotides สำหรับ knockdowns antisense, หนึ่งในเทคโนโลยีการรักษากรดนิวคลีอิกต้นและยังคงติดตาม² phosphorothioate oligonucleotides ลดการแสดงออกของยีนโดยการผสมกับ mRNA เป้าหมายซึ่งในทางกลับกันยับยั้งการเจริญเติบโตของ mRNA ทำให้การสลายตัวของ RNase H-mediated ของทรานสคริปท์หรือบล็อกการแปล³

นอกเหนือจาก เทคโนโลยี vivo เช่น antisense แล้ว phosphorothioate ยังมักใช้กับ เทคโนโลยีในหลอดทดลองด้วยเหตุผลที่คล้ายคลึงกันเช่นเพื่อป้องกันการเสื่อมสภาพของนิวเคลียส ตัวอย่างเช่นอะแดปเตอร์การจัดลำดับรุ่นต่อไป oligonucleotides มักถูกปรับเปลี่ยนที่การเชื่อมต่ออินเทอร์เน็ต 3 ' เพื่อป้องกันการย่อยสลายโดยเอนไซม์ที่ใช้ในระหว่างการเตรียมไลบรารี⁴

Physical Properties

ในขณะที่การเชื่อมโยงระหว่างฟอสฟอรัสอินเตอร์คูเลโอไทด์มีความทนทานต่อนิวเคลียสการแนะนำพันธบัตรดังกล่าวมากเกินไปจะช่วยลดการทำงานของ oligonucleotide โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับ antisense นี่เป็นเพราะกระบวนการซัลเฟตที่ใช้ในระหว่างการสังเคราะห์สร้างอะตอม α ฟอสฟอรัสที่มีการสร้าง stereogenic (รูปที่ 2) ซึ่งส่งผลให้เกิด diastereomers (การกำหนดค่า 2 n -1 สำหรับ oligonucleotide ของความยาว n) การเหมารวมประเภทนี้มีคุณสมบัติการทำงานที่แตกต่างกันซึ่งบางอย่างส่งผลเสียต่อการต่อต้าน อย่างไรก็ตามผลกระทบเชิงลบที่อาจเกิดขึ้นของ diastereomers สามารถลดลงได้โดยการรวมการปรับเปลี่ยนอย่างเหมาะสม

รูปที่ 2 สเตอรีโอเจน α รับฟอสฟอรัสที่จุดเชื่อมต่อระหว่างอินทูคลีโอไทด์หนึ่งจุด การกำหนดค่า R และ S แบบสุ่มทำให้เกิด diastereomers

แนวทางการจัดตั้งบริษัท

เนื่องจากผลของการปรับเปลี่ยนการเชื่อมโยง internucleotide มักไม่สามารถคาดเดาได้³การออกแบบของ polorothioate oligonucleotides ที่มีประสิทธิภาพเพื่อต่อต้านการย่อยสลายมักเป็นกระบวนการทดลองและข้อผิดพลาด (รูปที่  3 สำหรับรูปแบบลำดับตัวอย่าง) การเชื่อมโยงฟอสฟอรัสไม่จำเป็นต้องมีอยู่ตลอด oligonucleotide แต่ควรพิจารณาสิ่งต่อไปนี้:

        •  เพื่อต่อต้าน exonucleases oligonucleotide ควรมีการเชื่อมโยงฟอสฟอรัสที่อยู่ใกล้ทั้งปลาย 5 ' และ 3 '
        •  เพื่อต่อต้าน endonucleases oligonucleotide ควรมีการเชื่อมโยงฟอสฟอรัสตลอดทั้ง ดับ

ควรใช้จำนวนขั้นต่ำของการรวมตัวกันซึ่งโดยทั่วไปจะกำหนดโดยการทดลองเพื่อป้องกันผลกระทบเชิงลบที่มาพร้อมกับส่วนผสมของ diastereomeric รวมถึง: 1) การรบกวนกับ oligonucleotide: thermodynamics การผสมเป้าหมายที่นำมาโดยอุณหภูมิหลอมที่ต่ำกว่า_(TM)- เป็นผลมาจากอุปสรรค steric ของการกำหนดค่าบางอย่างซึ่งเพิ่มความแข็งแกร่งของโมเลกุลและ 2) การเชื่อมโยงนอกเป้าหมาย - การเชื่อมต่อฟอสฟอรัสที่มากเกินไปสามารถทำให้ oligonucleotides ' เหนียว อาจนำไปสู่ผลกระทบ antisense ปลอมและดังนั้นจึงเพิ่มโอกาสของความเป็นพิษต่อเซลล์
 

                                         ACGTACGTACGTACGT               A * C * G * TACGTACGTACGTA * C * G * T

                                        ฟอสฟอรัส oligonucleotide                phosphorothioate oligonucleotide

รูปที่ 3 ตัวอย่างรูปแบบลำดับที่ย่อของ phosphodiester และ phosphorothioate oligonucleotides ที่มีลำดับเดียวกัน การเชื่อมโยงระหว่างฟอสฟอรัสอินเตอร์คูลโอไทด์ไม่ได้มีเครื่องหมายดอกจัน อย่างที่เห็นลำดับมีจำนวนการรวมตัวกันน้อยที่สุดและได้รับการออกแบบมาเพื่อป้องกันการสัญญาเช่าแบบ exonuclease สมมติ

นอกจากนี้เมื่อขอ phosphorothioate oligonucleotides กับการปรับเปลี่ยนสิ่งสำคัญคือต้องพิจารณาว่าปฏิกิริยา stoichiometry สามารถลดลงได้ซึ่งจะนำไปสู่อัตราผลตอบแทนขั้นต่ำที่ต่ำกว่าของ phosphorothioate oligonucleotides    เท่านั้น (มาตรฐาน DNA Synthesi ทรายที่กำหนดเอง DNA Oligos การปรับเปลี่ยนอัตราผลตอบแทนต่ำสุดของ phosphorothioate เท่านั้นและฟอสฟอรัสที่ปรับเปลี่ยนตามลำดับ)

การทำให้บริสุทธิ์ (Purification)

phosphorothioate oligonucleotides สามารถทำให้บริสุทธิ์ผ่าน HPLC ซึ่งเป็นประโยชน์เนื่องจากมักใช้ในร่างกายและดังนั้นจึงต้องมีความเป็นเนื้อเดียวกันสูงสุดที่เป็นไปได้เพื่อหลีกเลี่ยงผลกระทบของ cytotoxic การผูกนอกเป้าหมายฯลฯ อย่างไรก็ตามยอด HPLC จะค่อนข้างกว้างกว่าของ oligonucleotides phosphodiester เนื่องจากความโน้มเอียงของ poliothioate oligonucleotides มากขึ้นในการสร้างโครงสร้างรองรวมทั้งประกอบด้วยส่วนผสม diastereomeric (การวิเคราะห์โปรไฟล์ Chromatography ของ phosphorothioate oligonucleotides)

สรุป

ฟอสฟอรัสมีประสิทธิภาพในการลดการเสื่อมสภาพของนิวคลีอิกของ oligonucleotides ที่จำเป็นสำหรับทั้งในร่างกายและเทคโนโลยีในหลอดทดลอง มีเครื่องชั่งและเครื่องสังเคราะห์หลายแบบเพื่อตอบสนองความต้องการด้านการวิจัยและประยุกต์ 

ข้อมูลอ้างอิง

1. Putney SD, Benkovic SJ, Schimmel PR. 1981. A DNA fragment with an alpha-phosphorothioate nucleotide at one end is asymmetrically blocked from digestion by exonuclease III and can be replicated in vivo.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78(12):7350-7354. https://doi.org/10.1073/pnas.78.12.7350

2. Eckstein F. 2014. Phosphorothioates, Essential Components of Therapeutic Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 24(6):374-387. https://doi.org/10.1089/nat.2014.0506

3. Chan JH, Lim S, Wong WF. 2006. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES: FROM DESIGN TO THERAPEUTIC APPLICATION. Clin Exp Pharmacol Physiol. 33(5-6):533-540. https://doi.org/10.1111/j.1440-1681.2006.04403.x

4. Shin J, Ming G, Song H. 2014. Decoding neural transcriptomes and epigenomes via high-throughput sequencing. Nat Neurosci. 17(11):1463-1475. https://doi.org/10.1038/nn.3814