ข้อมูลเบื้องต้นเกี่ยวกับปฏิกิริยาลูกโซ่โพลิเมอร์ (PCR)

What is PCR?

ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) เป็นเทคนิคชีววิทยาโมเลกุลทั่วไปที่ช่วยให้นักวิจัยสามารถทำสำเนาหลายของภูมิภาคเฉพาะของดีเอ็นเอ PCR มีประสิทธิภาพรวดเร็วและสามารถขยายลำดับ DNA หรือ RNA จากแหล่งต่างๆได้ เมื่อดีเอ็นเอได้รับการขยายอย่างเพียงพอแล้วผลิตภัณฑ์ที่ได้จะถูกจัดลำดับวิเคราะห์โดยเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสหรือโคลนลงในพลาสมิดเพื่อการทดลอง  

PCR ทำงานอย่างไร What are the steps of PCR?

ปฏิกิริยา PCR ที่เรียบง่ายประกอบด้วยดีเอ็นเอเป้าหมายชุดของไพรเมอร์ oligonucleotide สังเคราะห์ที่หมุนลำดับดีเอ็นเอเป้าหมายโพลิเมอร์ DNA ที่มีความเสถียรต่ออุณหภูมิ (โดยปกติจะเป็น Ta qpolymerase) และนิวคลีโอไทด์ ขั้นตอนสามขั้นตอนในแต่ละวงจรการขยายสัญญาณได้แก่การลดความอิ่มตัวการหลอมและการขยาย

1. ประการแรกดีเอ็นเอถูกตัดออกโดยการให้ความร้อนถึง 90-95 ˚C ซึ่งแยกดีเอ็นเอสองชั้น (DSDNA) ออกเป็นดีเอ็นเอเดี่ยวที่ติดอยู่ อุณหภูมิที่ร้อยละ 50 ของ dsDNA ถูกแปลงเป็นที่รู้จักกันในชื่ออุณหภูมิหลอม_(TM)และถูกกำหนดโดยเนื้อหา G + C ความยาวของตัวอย่างและความเข้มข้นของไอออน (หลัก mg²+)
2. ในระหว่าง ขั้นตอนการอบอ่อนตัวอย่างจะถูกระบายความร้อนด้วยอุณหภูมิ 40-60 ˚C ซึ่งจะช่วยให้ไพรเมอร์สามารถยึดติดกับ DNA เป้าหมายได้
3. ขั้นตอน PCR สุดท้ายจะเกิดขึ้นที่ 70-75 ˚C และเป็นที่ทราบกันว่าเป็น การยืดขยาย ในขั้นตอนนี้ DNA พอลิเมอเรสขยายดีเอ็นเอจากไพรเมอร์สร้างดีเอ็นเอใหม่ด้วยเส้นเก่าและเส้นใหม่

ไพรเมอร์ PCR คืออะไร

ไพรเมอร์เป็นกรดนิวคลีอิก (oligonucleotides สังเคราะห์) ที่จำเป็นในการเริ่มต้น PCR ดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอเส้นเดียวเหล่านี้มีความเฉพาะเจาะจงและสอดคล้องกับส่วนลำดับ DNA/อาร์เอ็นเอเป้าหมาย ในระหว่างขั้นตอนการระบายความร้อน (การหลอม) ของ PCR ไพรเมอร์จะจับกับเป้าหมายและเริ่มการคัดลอกลำดับ DNA/RNA เป้าหมาย ไพรเมอร์จะถูกใช้เป็นคู่หรือที่เรียกว่าไพรเมอร์ไปข้างหน้าและย้อนกลับ เรา offe rcustom oligo sin หลายรูปแบบ.  

ลำดับไพรเมอร์จะต้องถูกเลือกเพื่อกำหนดเป้าหมายพื้นที่ที่ไม่ซ้ำกันของดีเอ็นเอหลีกเลี่ยงความเป็นไปได้ของการผสมพันธุ์กับลำดับที่คล้ายกัน เมื่อออกแบบไพรเมอร์คู่ควรมีอุณหภูมิหลอมเหลวที่คล้ายกันเนื่องจากขั้นตอนการหลอมเกิดขึ้นสำหรับทั้งสองเส้นพร้อมกัน ยิ่งไปกว่านั้นไพรเมอร์ที่มี _TM (อุณหภูมิหลอมเหลว) สูงกว่าอุณหภูมิการหลอมของปฏิกิริยามากเกินไปอาจทำให้เกิดการผสมและขยายตัวในลำดับดีเอ็นเอที่ไม่พึงประสงค์  _TM ที่ต่ำกว่าอุณหภูมิการอบอ่อนมากอาจส่งผลให้การอบอ่อนล้มเหลว

PCR สร้าง DNA ได้กี่สำเนา

เนื่องจากเกลียวที่สังเคราะห์ขึ้นในวงจร PCR หนึ่งรอบทำหน้าที่เป็นเทมเพลตในรอบถัดไปจึงสามารถเพิ่มปริมาณ DNA ได้เป็นล้านเท่าในรอบเพียง 20 รอบ รอบเหล่านี้สามารถทำได้โดยอัตโนมัติโดยใช้เครื่องมือไซโคลนความร้อน^1,2,3

Popular PCR Products

PCR ประจำจะใช้ในการสร้างดีเอ็นเอจำนวนมากสำหรับการใช้งานปลายทางรวมถึงการตรวจสอบความยาวของโคลน Our products offer a variety of options to perform routine PCR. ส่วนผสมของปฏิกิริยา ReadyMix ™ PCR และ ตัวเลือกสีย้อม REDTaq ® ของเราช่วยเพิ่มความสะดวกสบายให้กับปฏิกิริยาการขยายเสียงของคุณ   

• พอลิเมอราสดีเอ็นเอของ Taq
• ส่วนผสมปฏิกิริยา PCR
  
• Roche AptaTaq เริ่มต้นอย่างรวดเร็ว DNA Polymerase
• Roche Expand™
• โรช FastStart ™ Taq

พอลิเมอราสดีเอ็นเอของ Taq

Taq DNA polymerase เป็นเอนไซม์ที่มีความร้อนเฉพาะที่แยกได้จาก Thermus aquaticus ซึ่ง เป็นแบคทีเรีย thermophilic TA QIS DNA polymerase ที่ใช้กันมากที่สุดสำหรับ PCR และตอนนี้แสดงออกมาใหม่ใน E. coli เอนไซม์มีความสามารถในการทำโพลิเมอร์ 5 → 3 นิ้วและกิจกรรม exonuclease การตรวจสอบหน้า SDS ไม่พบการปนเปื้อนที่ตรวจพบได้ที่เกี่ยวข้องกับ endonucleases หรือ exonucleases

 โพลิเมอร์ DNA REDTaq ®

REDTaq^® DNA Polymerase เป็นส่วนผสมที่เป็นเอกลักษณ์ของ  โพลิเมอร์ดีเอ็นเอ Taq ที่มีสีแดงเฉื่อย ชาผสมนี้มีประสิทธิภาพเช่นเดียวกับการ  ผสมผสาน Ta qenzyme ที่ชัดเจนและไม่รบกวนการใช้งานปลายน้ำ หน้าที่หลักของมันคือการระบุตัวตน - โซลูชันสามารถติดตามได้ง่ายในหลอด PCR และเจล หากจำเป็นสามารถถอดสีย้อมออกได้ด้วยวิธีการทำให้บริสุทธิ์มาตรฐานหลังการขยาย

รูปที่ 1 อัตราผลตอบแทนของโพลิเมอร์ดีเอ็นเอ REDTaq ® เมื่อเทียบกับ Taq มาตรฐานภายใต้สภาวะที่เหมือนกัน

รูปที่ 2 สีย้อม REDTaq ® จะเปลี่ยนไปเหมือนกับชิ้นส่วน 125 bp ดังนั้นจึงไม่จำเป็นต้องโหลดบัฟเฟอร์และสีย้อมติด

ส่วนผสมปฏิกิริยา PCR

  ส่วนผสมของปฏิกิริยา ReadyMix ™ PCR ประกอบด้วย  โพลิเมอร์ดีเอ็นเอ Taq คุณภาพสูงของเรา, dNTP บริสุทธิ์ 99 เปอร์เซ็นต์และบัฟเฟอร์ในสารละลายเข้มข้นของปฏิกิริยาที่ได้รับการปรับให้เหมาะสม 2 เท่า ผลิตภัณฑ์ที่สะดวกนี้ช่วยลดการวางท่อและลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนโดยการขจัดขั้นตอนการผสมต่างๆ เพียงเพิ่มเทมเพลตและไพรเมอร์ลงในมิกซ์ปฏิกิริยา ReadyMix ™ ส่วนผสมปฏิกิริยา PCR ถูกกำหนดขึ้นเพื่อตอบสนองความต้องการ PCR ต่างๆและสามารถซื้อร่วมกับ สีย้อม REDTaq ® เพื่อความสะดวกเพิ่มเติม

รูปที่ 3 การขยายส่วนย่อยของ 1 2 3 และ 7 kb และ DNA จีโนมิกของมนุษย์ 4.5 kb โดยใช้มิกซ์ปฏิกิริยา ReadyMix ™ Taq PCR

ข้อมูลอ้างอิง

1. Innis M. A. 2012. PCR protocols: a guide to methods and applications.. Academic press.

2. Haynie DT. 2001. Biological Thermodynamics. https://doi.org/10.1017/cbo9780511754784

3. McPherson, Mike, Simon M. 2000. PCR. London: Taylor & Francis.