[ข้ามไปยังเนื้อหา](https://www.sigmaaldrich.com#main-content) [![Merck](https://www.sigmaaldrich.com/static/logos/purple/merck.svg)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th) สินค้า รถเข็น0 THTH สินค้า [เข้าสู่ระบบ / ลงทะเบียน](https://www.sigmaaldrich.com/oidc-sign-in) [ค้นหาคำสั่งซื้อ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/order-lookup) [สั่งซื้อด่วน](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/quick-order) รถเข็น0 [หน้าแรก](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th)[qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/applications/genomics/qpcr)พื้นฐาน PCR เชิงปริมาณ # พื้นฐาน PCR เชิงปริมาณ *A Technical Guide to PCR Technologies* __ในหน้านี้__ - [Basic Principles](https://www.sigmaaldrich.com#basic) - [การวัดปริมาณและการวิเคราะห์เป้าหมาย gDNA](https://www.sigmaaldrich.com#targets) - [การวัดปริมาณและการวิเคราะห์ทรานสคริปท์ mRNA](https://www.sigmaaldrich.com#mrna) - [การวัดปริมาณและการวิเคราะห์ทรานสคริปท์ของ ncRNA](https://www.sigmaaldrich.com#transcripts) - [qPCR Requirements](https://www.sigmaaldrich.com#qpcr) - [แนวทาง MIQE](https://www.sigmaaldrich.com#miqe) - [Are You MIQE Compliant?](https://www.sigmaaldrich.com#are) การตรวจหา PCR เชิงปริมาณ (PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณอย่างเป็นทางการ, qPCR) สร้างขึ้นจากเทคนิค PCR พื้นฐานและช่วยให้นักวิจัยสามารถประมาณปริมาณของวัสดุเริ่มต้นในตัวอย่างได้ เนื่องจากผลิตภัณฑ์ถูกตรวจพบว่าเป็นรายได้จากปฏิกิริยา QPCR จึงมีช่วงการวิเคราะห์แบบไดนามิกที่กว้างกว่า PCR แบบทั่วไปและแบบจุดสิ้นสุดจากสำเนาชุดเดียวไปจนถึงประมาณ 101 1 ชุดสามารถตรวจพบได้ภายในการรันครั้งเดียว PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณและการตรวจจับแอมพลิฟายเออร์ที่ตามมาจะดำเนินการในรูปแบบท่อปิดซึ่งจะช่วยลดความจำเป็นในการจัดการหลัง PCR เช่นเจลอิเล็กโตรโฟเรซิสและลดความเสี่ยงของการปนเปื้อนข้ามได้อย่างมาก หลักการพื้นฐานของ qPCR จะกล่าวถึงในหน้านี้และกลไกของสารเคมีในการตรวจจับทั่วไปจะอธิบายไว้ใน [PCR เชิงปริมาณและวิธีการตรวจจับ PCR แบบดิจิตอล](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/quantitative-pcr-and-digital-pcr-detection-methods) ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Basic Principles เมื่อทำ qPCR สีย้อมของตัวรายงานฟลูออเรสเซนต์จะถูกใช้เป็นตัววัดทางอ้อมของปริมาณกรดนิวคลีอิกที่มีอยู่ในระหว่างรอบการขยายแต่ละรอบ การเพิ่มขึ้นของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์จะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณของโมเลกุลของผลิตภัณฑ์ PCR ที่สะสมตัวแบบทวีคูณ (แอมพลิฟายเออร์) [](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/polymerase-chain-reaction)ที่เกิดขึ้นในระหว่างขั้นตอนการเกิดปฏิกิริยาซ้ำ (ดูปฏิกิริยาลูกโซ่ Polymerase) โมเลกุลของผู้รายงานจะถูกจัดประเภทเป็นสีย้อมติดสองชั้น (DDNA) สีย้อมติดกับไพรเมอร์หรือโอลิโกโนนิวคลีโอไทด์ที่ผสมสีย้อมเพิ่มเติมซึ่งเรียกว่าโพรบ ([วิธีตรวจ PCR เชิงปริมาณและ Digital PCR Detection Methods)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/quantitative-pcr-and-digital-pcr-detection-methods) การใช้สีย้อมที่มีผลผูกพันกับ dsDNA เช่น SYBR® Green I แสดงถึงรูปแบบที่ง่ายที่สุดของเคมีตรวจจับ เมื่อสารละลายมีอิสระหรือมีดีเอ็นเอเดี่ยวที่ติดอยู่เท่านั้น (single-stranded DNA หรือ ssDNA) สีย้อม SYBR Green I จะปล่อยแสงที่ความเข้มของสัญญาณต่ำ เมื่อ PCR ดำเนินไปและปริมาณของ dsDNA เพิ่มขึ้นสีย้อมจะผูกกับแอมพลิฟายเออร์มากขึ้นและความเข้มของสัญญาณจะเพิ่มขึ้น หรือโพรบ (หรือการรวมกันของสองขึ้นอยู่กับเคมีตรวจจับ) สามารถเพิ่มระดับความจำเพาะในการตรวจจับที่เกินกว่าสีย้อมที่มีผลผูกพันกับ dsDNA เนื่องจากจะเชื่อมโยงกับพื้นที่เฉพาะของเทมเพลตที่อยู่ระหว่างไพรเมอร์ รูปแบบโพรบที่ใช้กันมากที่สุดคือโพรบแบบสองฉลาก (DLP) หรือเรียกอีกอย่างว่า โพรบแบบไฮโดรไลซิสหรือโพรบแบบ TaqMan ®) DLP เป็น oligonucleotide ที่มีฉลากเรืองแสง 5 ' เช่น 6 FAM ™และ 3 ' โมเลกุลดับเช่นหนึ่งในดับเข้มเช่น BHQ®1 หรือ OQ ™ ([วิธีการตรวจจับ PCR เชิงปริมาณและดิจิตอล PCR)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/quantitative-pcr-and-digital-pcr-detection-methods) โพรบเหล่านี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อผสมผสานกับเทมเพลตระหว่างไพรเมอร์ทั้งสองและใช้ร่วมกับโพลิเมอร์ DNA ที่มีกิจกรรม exonuclease 5 ถึง 3 เมื่อ DLP มีอิสระในการแก้ปัญหาความเข้มของสัญญาณต่ำเพราะสีย้อมของผู้รายงานอยู่ใกล้กับความนุ่มนวลของดับเพลิง เนื่องจากมีการผลิตเทมเพลตมากขึ้นในระหว่างการเกิดปฏิกิริยาโพรบจะเชื่อมโยงกับเทมเพลตมากขึ้นซึ่งจะถูกแยกออกจากกิจกรรม exonuclease 5 ถึง 3 ของ DNA polymerase ที่ก้าวหน้า ความเข้มของสัญญาณฟลูออเรสเซนต์จะเพิ่มขึ้นเมื่อสีย้อมของผู้รายงาน 5 ถูกปล่อยออกมาเป็นสารละลาย การใช้โพรบที่ติดฉลากด้วยสีย้อมของผู้รายงานที่แตกต่างกันช่วยให้สามารถตรวจจับและวัดปริมาณของชิ้นงานหลายชิ้นได้พร้อมกันในปฏิกิริยาเดียว (มัลติเพล็กซ์) การวิ่ง QPCR โดยทั่วไปประกอบด้วยรอบการบ่มที่อุณหภูมิสลับกันซ้ำขั้นตอนการขี่จักรยาน 3.1 โปรไฟล์นี้มักใช้เมื่อสีย้อมที่มีผลผูกพันกับ DsDNA, Molecular Beacons หรือ Scorpion® Probes เป็นสารเคมีตรวจจับที่เลือกสำหรับ qPCR การยืดสีรองพื้นมีประสิทธิภาพมากที่สุดที่ 72°C เนื่องจากเป็นอุณหภูมิที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการประมวลผลของดีเอ็นเอโพลิเมอร์ส่วนใหญ่ ที่อุณหภูมิ 72°C โพลิเมอร์จะเกิดขึ้นในอัตราประมาณ 100 ฐานต่อวินาที อย่างไรก็ตามยังมีความสามารถในการประมวลผลที่อุณหภูมิต่ำกว่าซึ่งเพียงพอที่จะขยายแม่แบบที่สั้นกว่า โดยทั่วไปแอมพลิฟายเออร์ QPCR จะสั้นกว่า (< 200 ฐาน) เมื่อเทียบกับผลิตภัณฑ์ PCR ทั่วไปจึงมักใช้ส่วนขยายร่วมกับการหลอมในขั้นตอนเดียวที่ 60°C เมื่อทำงานกับ Probles ที่ติดฉลากแบบคู่ (ขั้นตอนการขี่จักรยาน 3.2 ขั้นตอน) ### [](https://www.sigmaaldrich.com)ขั้นตอนการขี่จักรยาน 3.1 ตัวอย่างของโปรไฟล์ QPCR มาตรฐานที่ใช้การย้อมสีที่มีผลผูกพันกับ dsDNA, Molecular Beacon หรือ การตรวจจับ Scorpions ® Probe - __การลดความอิ่มตัวเริ่มต้น:__ อุณหภูมิปฏิกิริยาจะเพิ่มขึ้นเป็น 95°C และตัวอย่างจะถูกบ่มเป็นเวลา 2 – 10 นาที (เวลาขึ้นอยู่กับกลไกการเริ่มร้อนของเอนไซม์โพลิเมอร์) เพื่อให้แน่ใจว่าเป้าหมายที่ซับซ้อนทั้งหมด (dsDNA) จะถูกแยกออกจากกันและมีการควั่นเพียงครั้งเดียวและสามารถขยายได้ - __การขี่จักรยาน:__ 1. __การลดความอิ่มตัว:__ อุณหภูมิปฏิกิริยาจะเพิ่มขึ้นเป็น 95°C เป็นเวลา 10 วินาทีเพื่อละลาย dsDNA ทั้งหมด 2. __การอบอ่อน:__ อุณหภูมิจะลดลงเป็น 60°C เป็นเวลา 30 วินาทีเพื่อส่งเสริมไพรเมอร์และโพรบ (ถ้ารวม) ที่มีผลผูกพันกับแม่แบบ 3. __ส่วนขยาย:__ การยืดตัวต่อมาเกิดขึ้นที่อุณหภูมิที่เพิ่มขึ้น 72°C ซึ่งเหมาะสำหรับการประมวลผลโพลิเมอร์ TaqDNA ระยะเวลาของการขยายจะขึ้นอยู่กับขนาดแอมพลิฟายเออร์ (30 วินาทีต่อ 1 kb) ระยะเวลาการยืดตัวขึ้นอยู่กับความยาวที่ต้องการของแอมพลิฟายเออร์และเอนไซม์ที่ใช้ เนื่องจากแอมพลิฟายเออร์ qPCR มีขนาดสั้นจึงมักใช้เวลา 5 – 30 วินาที - __ทำซ้ำ:__ ขั้นตอนที่ 1 – 3 จะทำซ้ำโดยปกติจะเป็นเวลา 40 รอบ ### [](https://www.sigmaaldrich.com)ขั้นตอนการขี่จักรยาน 3.2 ตัวอย่างโปรไฟล์ qPCR การขี่จักรยานสองขั้นตอนสำหรับการตรวจจับ DLP - __การลดความอิ่มตัวเริ่มต้น:__ อุณหภูมิจะเพิ่มขึ้นเป็น 95°C และปฏิกิริยาจะถูกบ่มเป็นเวลา 2 – 10 นาที (ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติการเริ่มต้นที่ร้อนของเอนไซม์พอลิเมอเรส) - __การขี่จักรยาน:__ 1. __การลดความอิ่มตัว:__ อุณหภูมิปฏิกิริยาจะเพิ่มขึ้นเป็น 95°C เป็นเวลา 10 วินาทีเพื่อละลาย dsDNA ทั้งหมด 2. __การหลอมและการขยาย:__ อุณหภูมิจะลดลงเป็น 60°C เป็นเวลา 30 วินาทีเพื่อส่งเสริมไพรเมอร์ที่มีผลผูกพันกับแม่แบบและการยืดตัวที่ตามมาเกิดขึ้นเนื่องจากกิจกรรมที่เพียงพอของดีเอ็นเอพอลิเมอเรสที่อุณหภูมินี้ - __ทำซ้ำ:__ ขั้นตอนที่ 1 – 2 จะทำซ้ำโดยปกติจะเป็นเวลา 40 รอบ การเปลี่ยนแปลงของฟลูออเรสเซนซ์ในระหว่างการเกิดปฏิกิริยาจะวัดโดยรอบความร้อน PCR แบบเรียลไทม์ เครื่องมือ PCR แบบเรียลไทม์โดยเฉพาะจะรวมการหมุนเวียนอุณหภูมิเข้ากับออปติคัลยูนิต ออปติคอลยูนิตให้แสงที่ความยาวคลื่นที่เหมาะสมเพื่อเร่งฟลูออโรฟิลและตรวจจับการปล่อยแสงที่เกิดขึ้น เครื่องมือที่ทันสมัยจำนวนมากมีหน้าจอแสดงผลที่ติดอยู่หรือจอภาพคอมพิวเตอร์ที่อยู่ใกล้เคียงซึ่งช่วยให้สามารถติดตามปฏิกิริยาได้ในขณะที่มันดำเนินไป (__รูปที่ 3.1__) ![ตัวอย่างข้อมูลการวิเคราะห์ qPCR](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/qpcr/quantitative-pcr-cycle-ab.jpg "ตัวอย่างข้อมูลการวิเคราะห์ qPCR") __รูปที่ 3.1__ตัวอย่างข้อมูลการวิเคราะห์ qPCR a) ขั้นตอนต่างๆของปฏิกิริยา เส้นฐาน: ความเข้มข้นเริ่มต้นของแม่แบบอยู่ในระดับต่ำดังนั้นความเข้มของการเรืองแสงจึงต่ำเกินกว่าที่จะตรวจจับได้และมีเพียงสัญญาณพื้นหลังเท่านั้นที่สามารถมองเห็นได้ เอ็กซ์โพเนนเชียล: หลังจากที่ผลผลิตเป้าหมายถึงเกณฑ์การตรวจจับแล้วแสดงเป็นเส้นเกณฑ์ขั้นต่ำสีแดงสามารถทำตามขั้นตอนของปฏิกิริยาผ่านระยะเอ็กซ์โพเนนเชียลได้ เส้นตรง: เมื่อความเข้มข้นของแม่แบบเพิ่มความเข้มข้นของ DNA พอลิเมอเรสที่มีอยู่จะลดลงและอัตราการเกิดปฏิกิริยาจะลดลง ที่ราบสูง: ปฏิกิริยาอยู่ที่ผลผลิตสูงสุด ข) ปฏิกิริยาของแต่ละบุคคลมีลักษณะตามรอบที่ฟลูออเรสเซนส์เพิ่มขึ้นเหนือเกณฑ์ซึ่งเรียกว่าวงจรควอนตัม (Cq) หากมีวัสดุเริ่มต้นมากจะสังเกตเห็นการขยายในรอบก่อนหน้านี้และ Cq จะต่ำกว่า หากวัสดุเริ่มต้นมีน้อยจะสังเกตการขยายในรอบถัดไปและ Cq สูงกว่า ความสัมพันธ์ระหว่างฟลูออเรสเซนซ์, Cq และปริมาณของผลิตภัณฑ์ที่ขยายช่วยให้สามารถวัดปริมาณเทมเพลตในช่วงไดนามิกที่กว้างได้ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)การวัดปริมาณและการวิเคราะห์เป้าหมาย gDNA PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณสามารถนำไปใช้กับการวิเคราะห์เป้าหมาย gDNA ได้อย่างง่ายดาย การศึกษาดังกล่าวอาจเป็น การกำหนดจีโนไทป์/SNP การวิเคราะห์ methylation การคัดกรองลำดับการถ่ายโอนหรือการตรวจสอบการแทรกและการลบ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)การวัดปริมาณและการวิเคราะห์ทรานสคริปท์ mRNA การใช้ qPCR ร่วมกันคือการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนเช่นการเปรียบเทียบความเข้มข้นของยีนที่น่าสนใจของ mRNA ระหว่างตัวอย่างควบคุมและตัวอย่างที่ได้รับการรักษา mRNA สามารถวัดปริมาณได้ผ่านกระบวนการ RT-qPCR [แบบสองขั้นตอนหรือหนึ่งขั้นตอน (ดูที่ Reverse Transcription Quantitative Real-Time PCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/reverse-transcription)สำหรับรายละเอียดเพิ่มเติมของปฏิกิริยา RT) ### RT-qPCR สองขั้นตอน การถอดสคริปต์ย้อนกลับและปฏิกิริยา QPCR จะดำเนินการตามลำดับในหลอดแยกต่างหาก ทั้ง RNA ทั้งหมดหรือ โพลีน้อยกว่า (A)+ RNA ใช้เป็นวัสดุเริ่มต้นและ cDNA ผลิตโดยการยืดตัวจากไพรเมอร์ oligo-DT, ไพรเมอร์สุ่ม, การผสมผสานของไพรเมอร์ oligo-DT/ไพรเมอร์สุ่มหรือไพรเมอร์เฉพาะยีนโดยใช้เอนไซม์ transcriptase ย้อนกลับ จากนั้นจะเพิ่มอะลิควอทของปฏิกิริยานี้ลงใน qPCR ### RT-qPCR ขั้นตอนเดียว เมื่อการถอดสคริปต์ย้อนกลับและปฏิกิริยา qPCR ถูกรวมเข้าด้วยกันเป็นหลอดเดียวการตั้งค่าการทดลองจะง่ายขึ้น และมีโอกาสปนเปื้อนน้อยลงเนื่องจากไม่มีข้อกำหนดสำหรับการจัดการตัวอย่างต่อไป ## [](https://www.sigmaaldrich.com)การวัดปริมาณและการวิเคราะห์ทรานสคริปท์ของ ncRNA RT-qPCR ที่ไม่มีการเข้ารหัสส่วนใหญ่จะมีความยาวมากกว่า 100 นิวคลีโอไทด์ดังนั้นจึงสามารถตรวจจับและวัดค่าได้โดย RT-qPCR ด้วยเทคนิคเดียวกันกับที่ใช้ในการวิเคราะห์ mRNA ในทางกลับกัน RNA ที่ไม่มีการเข้ารหัสแบบสั้นเช่น RNA แบบไมโครและแบบพายเป็นความยาวของไพรเมอร์ PCR หนึ่งตัว ด้วยเหตุนี้จึงจำเป็นต้องใช้เทคนิคที่ช่วยยืด RNAs แบบสั้นเหล่านี้ก่อนที่จะดำเนินการ qPCR มีการนำสองวิธีหลักมาใช้ในระบบที่มีจำหน่ายในท้องตลาด: 1) การใช้สีรองพื้น rt stemloop และ 2 poly-a tailing ตามด้วย rt ด้วยสีรองพื้นอะแดปเตอร์ oligo-dt (__รูปที่ 3.2__) วิธีการทางเลือกที่พัฒนาโดย Casoldi et al. ซึ่งไม่มีในเชิงพาณิชย์ใช้การรวมของโมเลกุลอะแดปเตอร์กับ RNA ทั้งหมดในตัวอย่างและการออกแบบไพรเมอร์เฉพาะเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างเป้าหมายที่ต้องการ1,2 แนวทางสเต็มลูป RT ไพรเมอร์ได้รับการพัฒนาและทำการค้าโดยไบโอซิสเต็มส์ประยุกต์ (ปัจจุบันเทคโนโลยีชีวิต/เทอร์โม) สำหรับ QPCR ที่ใช้โพรบตาม TaqMan3 ดังที่แสดงใน __รูปที่ 3.2A__ปลาย 5 ของไพรเมอร์ RT สามารถจับคู่ฐานกับภูมิภาคนิวคลีโอไทด์หลายตัวจากปลาย 3 ของตัวเองเพื่อสร้างก้านคู่ฐานแยกด้วยลูปที่ไม่ได้จับคู่ ทั้งหมดยกเว้นนิวคลีโอไทด์ไม่กี่ตัวสุดท้ายที่ 3 '- ปลายของไพรเมอร์ RT เป็นสากลนั่นคือพวกเขามีลำดับเดียวกันในไพรเมอร์ miRNA ทั้งหมด นิวคลีโอไทด์สองสามตัวสุดท้ายที่ขยาย 3 ' จากลำต้นจะเสริมกับปลาย 3 ' ของ miRNA เป้าหมาย การขยายตัวของไพรเมอร์ตามแม่แบบ miRNA สร้าง cDNA ที่สามารถขยายด้วยไพรเมอร์ไปข้างหน้าเฉพาะ miRNA และไพรเมอร์ย้อนกลับสากลซึ่งเป็น ส่วนเสริมของไพรเมอร์ RT แบบวงลำต้น 5 ' วิธีการเชิงพาณิชย์อื่นๆทั้งหมดของ miRNA qPCR รวมถึง แบรนด์ MystiCq ® ของเราใช้โพลี - A tailing เพื่อยืด miRNA ตามที่อธิบายไว้โดย Shi และ Chiang4 Poly (A) Polymerase (PAP) ซึ่งเป็นเอนไซม์ที่ไม่ขึ้นกับเทมเพลตจะเร่งปฏิกิริยาการถ่ายโอนสารตกค้างจาก Adenosine จาก ATP ไปยังปลาย 3 ของ RNA ใดๆ ตามที่แสดงใน __รูปที่ 3.2B,__RT สามารถทำได้โดยใช้ไพรเมอร์ oligo-DT สีรองพื้น oligo-DT ประกอบด้วยลำดับอะแดปเตอร์ที่ระดับ 5 ซึ่งช่วยให้ qPCR ที่ตามมามีไพรเมอร์ไปข้างหน้าซึ่งเป็นส่วนเสริมของ miRNA เฉพาะและสีรองพื้นย้อนกลับที่เสริมกับลำดับอะแดปเตอร์ ![RT และ qPCR ของ miRNA](https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/cms-commons/sigmaaldrich/marketing/global/images/technical-documents/articles/genomics/qpcr/mirna-rt-q-pcr-ab.jpg "RT และ qPCR ของ miRNA") __รูปที่ 3.2__มีสองวิธีที่ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์สำหรับ RT และ qPCR ของ miRNA ก) ไพรเมอร์แบบลูปถูกใช้เพื่อปรับขั้นตอน RT หลังจากการผสมข้ามไปยังปลาย 3 ของ miRNA การขยาย PCR ผ่านลูปจะส่งผลให้เกิด miRNA และลำดับสากลที่รวมกันซึ่งยาวพอสำหรับการขยาย B) การเพิ่มหางโพลีเอไปยัง miRNA จะให้ไซต์รองพื้นสำหรับไพรเมอร์ที่ประกอบด้วยระบบทางเดิน oligo-DT และลำดับรองพื้นสากล การวิจัยกรดนิวคลีอิกโดย Oxford University Press ทำซ้ำโดยได้รับอนุญาตจาก Oxford University Press ในรูปแบบการนำกลับมาใช้ใหม่ในหนังสือ/หนังสืออิเล็กทรอนิกส์ผ่านศูนย์การกวาดล้างลิขสิทธิ์ ทั้งสองวิธีการเชิงพาณิชย์มีข้อดีและข้อเสีย การล่อแบบ Stem-loop ช่วยให้ RT-qPCR แบบ 2 ขั้นตอนในขณะที่วิธีการเก็บรวบรวมโพลี - เอส่วนใหญ่จำเป็นต้องมีขั้นตอนเพิ่มเติมสำหรับ RT ก่อน qPCR มีผลิตภัณฑ์ที่รวมโพลี - เอเทลิงและ RT ในปฏิกิริยาเดียวสำหรับการเทน้ำมัน PAP แบบ 2 ขั้นตอน/RT-qPCR อย่างไรก็ตามการตรวจจับอาจมีความไวน้อยลงด้วยวิธีการนี้ (ผลลัพธ์ภายในที่ยังไม่ได้เผยแพร่) ในทางกลับกันโพลี - อะเทลิงตามด้วย RT จะสร้างสระว่ายน้ำ cDNA ที่มีความเสถียรซึ่งสามารถใช้ตรวจจับ microRNA, mRNA หรือ RNA อื่นๆได้ทันทีหรือตลอดเวลาในอนาคต ด้วยการเข้าใกล้ STEM-Loop/TaqMan จำเป็นต้องใช้ไพรเมอร์ที่แตกต่างกันในการตรวจจับ miRNA แต่ละตัว สามารถเพิ่มไพรเมอร์แบบ Stem-loop หลายตัวลงใน ไพรเมอร์ RT 5 และพูลเดียวกันสำหรับ miRNA หลายตัวได้จาก Life Technologies เพื่อดำเนินการ multiplex RT อย่างไรก็ตามไม่มีตัวเลือกใดที่จะช่วยให้สามารถตรวจหา miRNA ที่ค้นพบในภายหลังได้ qPCR และไม่อนุญาตให้ qPCR ตรวจจับ mRNA จาก cDNA เดียวกันได้ ระบบที่อธิบายโดย Castoldi et al1 2 เป็นเอกลักษณ์เฉพาะตัวที่มันไม่ได้ให้วิธีการในการตรวจจับโมเลกุล mRNA สารตั้งต้นและ miRNA ประมวลผลอย่างเต็มที่จากตัวอย่าง RNA รวมเดียวกัน ## [](https://www.sigmaaldrich.com)qPCR Requirements ### เครื่องมือ เครื่องมือ QPCR จำนวนมากได้รับการออกแบบมาเพื่อรองรับการใช้งานที่หลากหลายเช่นความสามารถในการตัดกันของเครื่องมือวัดปริมาณงานสูง ABI 7900 โดยใช้การโหลดแผ่นความร้อน 384 หลุมโดยอัตโนมัติด้วย Illumina ที่ผลิตและจำหน่ายเครื่องมือ Eco ที่รองรับแผ่นความร้อน 48 หลุมเดียว ดังนั้นเครื่องมือที่เหมาะสมที่สุดจึงตรงกับความต้องการของการวิจัย เป็นที่พึงปรารถนาที่จะเลือกเครื่องมือที่มีซอฟต์แวร์ที่ใช้งานง่ายซึ่งทำหน้าที่เป็นที่ต้องการมากที่สุดและมีความยืดหยุ่นในแง่ของการส่งออกข้อมูลเพื่อให้สามารถจัดการได้ง่ายในแพคเกจซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ทางสถิติดาวน์สตรีม ซึ่งจะช่วยลดเวลาที่ต้องใช้ในการฝึกอบรมบุคลากรดังนั้นจึงสามารถเริ่มสร้างผลลัพธ์ได้ คุณสมบัติเพิ่มเติมที่จำเป็นได้แก่บล็อก PCR ที่มีความสม่ำเสมออย่างแน่นอน (ค่าเบี่ยงเบนสูงสุดสัมบูรณ์ของ 1 cq = 2 เท่าของการจำลองแบบ 96 หลุม) และระบบลำแสงที่สร้างความตื่นเต้นและตรวจจับการปล่อยแสงได้อย่างมีเหตุผลและเท่ากันมากที่สุดในช่วงความยาวคลื่นที่กว้าง ซึ่งจะช่วยให้สามารถเลือกฟลูออโรฟอรอเรสได้หลากหลายและทำให้สามารถมัลติเพล็กซิ่งได้ คุณสมบัติอื่นๆที่ต้องพิจารณาคือต้นทุนการดำเนินงานที่เกี่ยวข้องกับวัสดุสิ้นเปลืองที่เฉพาะเจาะจงเช่นหากแผ่นไมโครไทเตอร์มาตรฐานไม่ได้ใช้สำหรับปฏิกิริยาและความสะดวกในการโหลดแผ่น/ท่อที่ไม่ใช่รูปแบบมาตรฐาน ### Template ต้องมีการทำสำเนาของกรดนิวคลีอิกเป้าหมายน้อยมาก (เทียบเท่ากับ gDNA หรือ cDNA) ประมาณ 100 pg เพื่อเริ่มต้น qPCR เพื่อลดการปนเปื้อนด้วยสารยับยั้งการเกิดปฏิกิริยาควรเก็บจำนวนเทมเพลตเริ่มต้นไว้ที่ระดับต่ำสุดที่จำเป็นเพื่อให้ได้ปริมาณที่ถูกต้อง เมื่อวัสดุเริ่มต้นคือ RNA การออกแบบไพรเมอร์และการรักษา DNase I จะลดสัญญาณที่อาจเกิดจากการปนเปื้อน gDNA ### ไพรเมอร์ ไม่ว่าจะใช้สีย้อมที่มีผลผูกพันกับ dsDNA หรือเคมีตรวจจับที่ใช้โพรบการออกแบบไพรเมอร์คุณภาพสูงเป็นหนึ่งในขั้นตอนก่อนการทดลองที่สำคัญที่สุดใน qPCR สำหรับการอภิปรายโดยละเอียดเกี่ยวกับการออกแบบการวิเคราะห์ [PCR, qPCR, การออกแบบการวิเคราะห์ dPCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design) เพื่อเพิ่มความไวและความจำเพาะให้สูงสุดควรมีการดัดแปลงที่จำเป็นเช่นกรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อค ([เคมีตรวจจับ QPCR)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/quantitative-pcr-and-digital-pcr-detection-methods) ### Probe(s) เมื่อใช้โพรบเป็นกลไกการตรวจจับแอมพลิฟายเออร์จะไม่ตรวจจับไพรเมอร์ไดเมอร์และผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงแต่ควรหลีกเลี่ยงเนื่องจากสามารถลดประสิทธิภาพการตอบสนองได้ เพื่อเพิ่มความไวและความจำเพาะสูงสุดควรเลือกประเภทโพรบที่เหมาะสมสำหรับการใช้งานและการปรับเปลี่ยนที่จำเป็นเช่นกรดนิวคลีอิกที่ถูกล็อครวมอยู่ด้วย ([เคมีการตรวจจับ QPCR)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/quantitative-pcr-and-digital-pcr-detection-methods) ### dNTPs [PCR มาตรฐานและ qPCR หลัก Mixe](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/pcr-master-mix) มี dATP, dCTP, DGTP และ dTTP อย่างไรก็ตามมีมิกซ์บางรายการที่แทนที่ dTTP ด้วย dUTP ผลิตภัณฑ์จากปฏิกิริยาก่อนหน้านี้ทำงานด้วย dUTP จะมี uracil แทน thymine ซึ่งจะทำให้เกิดความแตกแยกได้ง่ายโดย uracil-DNA-Glycosylase (UNG) ดังนั้นก่อนการบ่มเชื้อปฏิกิริยาที่ตามมากับ UNG จะช่วยป้องกันการปนเปื้อนของสารก่อโรคระหว่างปฏิกิริยา เพื่อให้มีประสิทธิภาพ PCR ทั้งหมดในห้องปฏิบัติการต้องใช้ dUTP ### แมกนีเซียม แมกนีเซียมคลอไรด์ (MgCl2) เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับ reverse transcriptase, taq DNA polymerase และ taq DNA 5 ' ถึง 3 ' กิจกรรม exonuclease  ความเข้มข้นของมิลลิกรัม 2 + ที่เหมาะสมสำหรับปฏิกิริยาที่มี dLPS มักจะอยู่ระหว่าง 3 – 6 มม. ส่วนผสมหลักส่วนใหญ่ประกอบด้วย MgCl2อย่างไรก็ตามบางครั้งก็จำเป็นต้องเพิ่มความเข้มข้นดังนั้นหลอด MgCl 2 บริสุทธิ์เพิ่มเติมมักจะรวมอยู่ในผลิตภัณฑ์ผสมหลัก (ดู [การเพิ่มประสิทธิภาพการทดสอบและการตรวจสอบ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation)) ในบางกรณี อาจต้องใช้ส่วนผสมปฏิกิริยาที่ไม่มี MgCl 2 เพื่อให้สามารถใช้ความเข้มข้นต่ำเช่นเมื่อใช้ การตรวจจับ Scorpions ® Probe ### Reverse Transcriptase เอนไซม์ transcriptase ย้อนกลับที่ให้ผลผลิตสูงของ cDNA ในขณะที่รักษากิจกรรมที่อุณหภูมิสูงเป็นสิ่งสำคัญต่อความสำเร็จของ RT-qPCR ประสิทธิภาพที่อุณหภูมิสูงช่วยให้มั่นใจได้ว่าภูมิภาคของ RNA ที่มีโครงสร้างรองที่สำคัญจะไม่เสถียรและสามารถเข้าถึงได้สำหรับการผสมข้ามและการขยายในภายหลัง เมื่อทำ RTqPCR แบบขั้นตอนเดียวประสิทธิภาพที่อุณหภูมิสูงจะช่วยให้สามารถใช้ไพรเมอร์พิเศษที่มีอุณหภูมิหลอมละลายสูง(TM)ซึ่งจะเพิ่มความจำเพาะของปฏิกิริยา เมื่อทำโปรโตคอลสองขั้นตอนสิ่งสำคัญคือต้องตรวจสอบให้แน่ใจว่าเอนไซม์ส่งผลให้ได้ cDNA แบบเส้นตรงและสัดส่วนจาก RNA ( [](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/gene-expression-and-silencing/reverse-transcription) ดูที่ Reverse Transcriptio nfor details of RT evaluation) ### ดีเอ็นเอของ Taq Polymerase เช่นเดียวกับการเลือก transcriptase ย้อนกลับที่เหมาะสมที่สุดสำหรับ RT การเลือกเอนไซม์พอลิเมอเรสที่เหมาะสมเป็นสิ่งสำคัญ ปัญหาพื้นฐานของพอลิเมอเรสดีเอ็นเอ Taq ธรรมชาติคือเอนไซม์มีกิจกรรมที่เหลืออยู่ที่อุณหภูมิต่ำ การผูกสีรองพื้นที่ไม่เฉพาะเจาะจงนำไปสู่การก่อตัวของผลิตภัณฑ์ที่ไม่เฉพาะเจาะจงอันเป็นผลมาจากกิจกรรมพอลิเมอเรสที่เหลืออยู่นี้ แอนติบอดีที่ถูกบล็อกหรือถูกบล็อกทางเคมีโพลิเมอร์ดีเอ็นเอ Taq ('hot start') ช่วยแก้ไขสถานการณ์นี้โดยการป้องกันการทำงานของเอนไซม์จนกว่าขั้นตอนการลดความอิ่มตัวของอุณหภูมิสูงจะเริ่มต้นขึ้น ### บัฟเฟอร์ บัฟเฟอร์หรือรีแอคชันมาสเตอร์มิกซ์โดยทั่วไปจะประกอบด้วย dNTPs, พอลิเมอเรสดีเอ็นเอ Taq, MgCl 2 และสเตบิไลเซอร์ SYBR Green I Dye, ROX ™, Fluorescein และ inert loading dyes อาจรวมอยู่ด้วย (การโหลดสีย้อมควบคุม) ขึ้นอยู่กับข้อกำหนดทางเคมีการตรวจจับเครื่องมือและปฏิกิริยา ส่วนประกอบบัฟเฟอร์ PCR และชุดกันโคลงโดยทั่วไปจะเป็นกรรมสิทธิ์ของผู้ผลิต หากซื้อแยกต่างหากจะมีความยืดหยุ่นสูงสุดเนื่องจากส่วนผสมแต่ละชนิดสามารถปรับให้เหมาะสมกับปฏิกิริยาแต่ละชนิดได้ อย่างไรก็ตามในทางกลับกันในขณะที่ซื้อส่วนผสมเข้าด้วยกันเป็นส่วนผสมหลักลดความยืดหยุ่นจะเพิ่มความสม่ำเสมอและความสะดวกสบายในการผลิตชุดในขณะที่ลดจำนวนขั้นตอนการปิเปตและดังนั้นโอกาสของข้อผิดพลาดและการปนเปื้อน ### โหลดสีย้อมควบคุม วงจรความร้อน PCR แบบเรียลไทม์บางอย่างจำเป็นต้องมีการย้อมสีเช่น ROX เพื่อรวมเข้ากับปฏิกิริยาแต่ละอย่างเพื่อควบคุมความผันแปรในระบบออปติคอลและเพื่อปรับความแตกต่างของความเข้มของสัญญาณให้เป็นปกติ ในทำนองเดียวกันวงจรความร้อนบางอย่างจำเป็นต้องมีสัญญาณฟลูออเรสเซนต์เริ่มต้นเพื่อสร้างพื้นหลังเสมือนเมื่อทำงานกับการทดสอบสีย้อม SYBR Green I (ซึ่งมีพื้นหลังต่ำมาก) ซึ่งอาจมีให้ในส่วนผสมหลักหรือเป็นส่วนประกอบแยกกันเพื่อให้สามารถใช้ความเข้มข้นที่เหมาะสมได้ ## [](https://www.sigmaaldrich.com)แนวทาง MIQE ปัญหาหนึ่งที่ชัดเจนเกี่ยวกับการใช้ qPCR คือการสร้างตัวเลขที่สามารถตีความได้อย่างง่ายดายว่าเป็นผลลัพธ์เชิงปริมาณ อย่างไรก็ตามสิ่งนี้อาจทำให้เข้าใจผิดได้อย่างเท่าเทียมกันเนื่องจากอาจต้องมีการควบคุมคุณภาพและการวิเคราะห์เพิ่มเติมเพื่อแยกแยะความแตกต่างระหว่างสิ่งแปลกปลอมที่อาจเกิดขึ้นซึ่งเกิดจากการออกแบบการวิเคราะห์การดำเนินการหรือการวิเคราะห์ข้อมูลที่ไม่เหมาะสม การเผยแพร่ข้อมูลสำคัญที่เห็นได้ชัดโดยไม่มีการควบคุมคุณภาพที่เพียงพอได้นำไปสู่รายงานที่ดีที่สุดไม่เกี่ยวข้องทางชีวภาพหรือทางคลินิกและที่แย่ที่สุดคือไม่ถูกต้อง แต่ละขั้นตอนของกระบวนการทดลอง qPCR ตั้งแต่การเก็บตัวอย่างไปจนถึงการวิเคราะห์ข้อมูล qPCR มีความเสี่ยงต่อความแปรปรวน6 ดังนั้นความผันแปรอาจเกิดขึ้นได้ในระหว่างการเลือกและการประมวลผลตัวอย่างการแยกกรดนิวคลีอิก (อาจส่งผลให้คุณภาพแตกต่างกันซึ่งทำให้ขาดความสามารถในการทำซ้ำของการตรวจจับเป้าหมาย qPCR) การออกแบบและการเพิ่มประสิทธิภาพการวิเคราะห์ (มีส่วนร่วมในความแตกต่างในประสิทธิภาพและความไวในการวิเคราะห์) และการวิเคราะห์ข้อมูล (ต้องมีการตีความแบบอัตนัยและการประยุกต์ใช้วิธีการทางสถิติที่เหมาะสม) เป็นสิ่งสำคัญที่ข้อมูลที่ให้กับผู้ชมทางวิทยาศาสตร์มีข้อมูลที่เพียงพอสำหรับการทดลองที่จะได้รับการประเมินอย่างมีวิจารณญาณ 7 แต่ก็เห็นได้ชัดว่านี่ไม่ใช่กรณีที่8 เสมอไป แนวทาง“ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการเผยแพร่การทดลอง PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ” (MIQE) 9 ระบุถึงข้อกังวลเหล่านี้ วัตถุประสงค์ของแนวทาง MIQE คือการเพิ่มความโปร่งใสโดยการระบุข้อมูลขั้นต่ำเกี่ยวกับการทดสอบที่จำเป็นสำหรับผู้อ่านเพื่อให้สามารถประเมินความถูกต้องทางเทคนิคของสิ่งพิมพ์และเพื่อให้คำแนะนำสำหรับการออกแบบการเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบการวิเคราะห์ QPCR ใหม่ MIQE ประกอบด้วยเก้าส่วน (การออกแบบการทดลอง, ตัวอย่าง, กรดนิวคลีอิก, การถอดสคริปต์ย้อนกลับ, เป้าหมาย, ไพรเมอร์และโพรบ, รายละเอียดการทดสอบ, การขี่จักรยาน PCR และการวิเคราะห์ข้อมูล ; เยี่ยมชม MIQE Pag EtO ของเราดาวน์โหลดรายการตรวจสอบ, __ตารางที่ 1__) พารามิเตอร์ทั้งหมดที่เกี่ยวข้องกับข้อมูลที่ควรได้รับในระหว่างกระบวนการของการออกแบบทดลองการเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบ เมื่อใช้การวิเคราะห์เชิงพาณิชย์หรือจากเอกสารที่เผยแพร่ควรใช้การเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบความถูกต้อง กระดาษ MIQE มีรายการตรวจสอบที่มีปัจจัยที่มีป้ายกำกับ Essential ซึ่งถือว่าเป็นสิ่งที่ขาดไม่ได้สำหรับคำอธิบายที่เพียงพอของการวิเคราะห์ qPCR ในขณะที่ส่วนประกอบอื่นๆจะมีป้ายระบุว่าข้อมูลนี้มีประโยชน์แต่แม้จะไม่มีการวิเคราะห์อาจถูกทำซ้ำและข้อมูลภายในสิ่งพิมพ์ที่ประเมิน สิ่งสำคัญคือต้องตระหนักว่าการรายงานประสิทธิภาพ PCR ความไวในการวิเคราะห์และความจำเพาะของแต่ละการวิเคราะห์เป็นสิ่งจำเป็นและผู้วิจัยควรพิจารณาโดยใช้เงื่อนไขในห้องปฏิบัติการ มีข้อควรพิจารณาเฉพาะเมื่อทำ PCR แบบดิจิตอล (ดูที่ [Digital PCR)](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/protocol/genomics/pcr/digital-pcr)ที่ได้รับการระบุไว้ในเอกสาร MIQE PCR แบบดิจิตอลฉบับล่าสุด10 ## [](https://www.sigmaaldrich.com)Are You MIQE Compliant? __ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการเผยแพร่การทดลอง PCR แบบเรียลไทม์เชิงปริมาณ__ | | | |---------------------------------------------------------------------------|----------------| | รายการตรวจสอบ MIQE สำหรับ QPCRa | EB ที่นำเข้า | | __การออกแบบเชิงทดลอง__ | | | คำจำกัดความของกลุ่มทดลองและกลุ่มควบคุม | สิ่งสำคัญ | | ตัวเลขภายในแต่ละกลุ่ม | สิ่งสำคัญ | | การวิเคราะห์ดำเนินการโดยห้องปฏิบัติการหลักหรือห้องปฏิบัติการของผู้วิจัย ? | เป็นที่ต้องการ | | การรับทราบผลงานของผู้เขียน | เป็นที่ต้องการ | | __ตัวอย่าง__ | | | คำอธิบาย | สิ่งสำคัญ | | ปริมาตร/มวลของตัวอย่างที่ผ่านกระบวนการ | เป็นที่ต้องการ | | ไมโครดิเซชั่นหรือแมคโครดิเซชั่น | สิ่งสำคัญ | | ขั้นตอนการประมวลผล | สิ่งสำคัญ | | ถ้าแช่แข็ง - วิธีการและวิธีการได้อย่างรวดเร็ว ? | สิ่งสำคัญ | | ถ้าแก้ไข - กับอะไรเร็วแค่ไหน ? | สิ่งสำคัญ | | เงื่อนไขและระยะเวลาการเก็บรักษาตัวอย่าง (โดยเฉพาะสำหรับตัวอย่าง FFPE) | สิ่งสำคัญ | | __การสกัดกรด Nudeic__ | | | ขั้นตอนและ/หรือเครื่องมือวัด | สิ่งสำคัญ | | ชื่อชุดยาและรายละเอียดของการดัดแปลงใดๆ | สิ่งสำคัญ | | แหล่งที่มาของน้ำยาเพิ่มเติมที่ใช้ | เป็นที่ต้องการ | | รายละเอียดการรักษา DNase หรือ RNAse | สิ่งสำคัญ | | การประเมินการปนเปื้อน (ดีเอ็นเอหรืออาร์เอ็นเอ) | สิ่งสำคัญ | | Nucleic acid quantification | สิ่งสำคัญ | | เครื่องมือและวิธีการ | สิ่งสำคัญ | | ความบริสุทธิ์ (A200/A200) | เป็นที่ต้องการ | | ผลผลิต | เป็นที่ต้องการ | | วิธีการ/เครื่องมือความสมบูรณ์ของ RNA | สิ่งสำคัญ | | Rin/RQI หรือ Co ของ 3 ' และ S ' ถอดเสียง | สิ่งสำคัญ | | Electrophoresis traces | เป็นที่ต้องการ | | การทดสอบการยับยั้ง (การ เจือจางร่วม, เข็มหรืออื่นๆ) | สิ่งสำคัญ | | __การถอดเสียงบรรยาย__ | | | เงื่อนไขการตอบสนองที่สมบูรณ์ | สิ่งสำคัญ | | ปริมาณ RNA และปริมาณปฏิกิริยา | สิ่งสำคัญ | | รองพื้น Oligonucleotide (หากใช้ GPS) และความเข้มข้น | สิ่งสำคัญ | | revers transcriptase และการรวมศูนย์ | สิ่งสำคัญ | | อุณหภูมิและเวลา | สิ่งสำคัญ | | การผลิตน้ำยาและหมายเลขแคตตาล็อก | เป็นที่ต้องการ | | 6cqs มีและไม่มี rt | เป็นที่ต้องการ | | Storage conditions of cDNA | เป็นที่ต้องการ | | __ข้อมูลเป้าหมาย QPCR__ | | | ถ้า multiplex ประสิทธิภาพและ LOD ของแต่ละการทดสอบ | สิ่งสำคัญ | | เลขทะเบียนลำดับ | สิ่งสำคัญ | | ตำแหน่งของแอมพลิจูด | เป็นที่ต้องการ | | Amplicon length | สิ่งสำคัญ | | ในหน้าจอ Silico specificity (ระเบิดฯลฯ) | สิ่งสำคัญ | | pseudogenes, retrospseudogenes ของ homologs อื่นๆ ? | เป็นที่ต้องการ | | Sequence alignment | สิ่งสำคัญ | | ตำแหน่งของไพรเมอร์แต่ละตัวโดย exon หรือ intron (ถ้ามี) | สิ่งสำคัญ | | มีการกำหนดเป้าหมายสายพันธุ์อะไรบ้าง ? | สิ่งสำคัญ | | __qPCR oligonucleotides__ | | | Primer sequences | สิ่งสำคัญ | | หมายเลขประจำตัว RTPrimerDB | เป็นที่ต้องการ | | dProbe sequences | เป็นที่ต้องการ | | ตำแหน่งและข้อมูลเฉพาะตัวของการแก้ไขใดๆ | สิ่งสำคัญ | | การผลิต oligonucleotides | เป็นที่ต้องการ | | Purification method | เป็นที่ต้องการ | Table 1รายการตรวจสอบแนวทาง MIQE | | | |--------------------------------------------------------------|-----------------| | รายการตรวจสอบ MIQE สำหรับ QPCRa | EB ที่นำเข้า | | __โปรโตคอล QPCR__ | | | เงื่อนไขการตอบสนองที่สมบูรณ์ | สิ่งสำคัญ | | ปริมาณปฏิกิริยาและปริมาณ cDNA/DNA | สิ่งสำคัญ | | ไพรเมอร์, (โพรบ), มก.\** และความเข้มข้นของ dNTP | สิ่งสำคัญ | | ตัวตนและความเข้มข้นของพอลิเมอเรส | สิ่งสำคัญ | | ตัวตนบัฟเฟอร์/ชุดและผู้ผลิต | สิ่งสำคัญ | | ส่วนประกอบทางเคมีที่แน่นอนของบัฟเฟอร์ | เป็นที่ต้องการ | | สารเติมแต่ง (SYBR Green I, DMSO, ฯลฯ) | สิ่งสำคัญ | | การผลิตแผ่น/ท่อและหมายเลขแคตตาล็อก | เป็นที่ต้องการ | | พารามิเตอร์ thermขี่ จักรยานที่สมบูรณ์ | สิ่งสำคัญ | | การตั้งค่าการตอบสนอง (ด้วยตนเอง/หุ่นยนต์) | เป็นที่ต้องการ | | การผลิตเครื่องมือ qPCR | สิ่งสำคัญ | | __qPCR Validation__ | | | หลักฐานของการเพิ่มประสิทธิภาพ (จากการไล่ระดับสี | เป็นที่ต้องการ | | ความจำเพาะ (เจล, ลำดับ, ละลายหรือย่อย) | สิ่งสำคัญ | | สำหรับ SYBR Green l บริษัทร่วม ของ NTC | สิ่งสำคัญ | | เส้นโค้งมาตรฐานที่มี slpoe และตัดแกน y | สิ่งสำคัญ | | ประสิทธิภาพ PCR คำนวณจากความลาดเอียง | สิ่งสำคัญ | | ช่วงเวลาการติดต่อสำหรับประสิทธิภาพ PCR หรือข้อผิดพลาดมาตรฐาน | เป็นที่ ต้องการ | | R2 ของเส้นโค้งมาตรฐาน | สิ่งสำคัญ | | ช่วงไดนามิคแบบเส้นตรง | สิ่งสำคัญ | | ความแปรผันของ CQ ที่ขีดจำกัดล่าง | สิ่งสำคัญ | | ช่วงความเชื่อมั่นตลอดช่วง | เป็นที่ต้องการ | | หลักฐานสำหรับการจำกัดการตรวจจับ | สิ่งสำคัญ | | ถ้า multiplex ประสิทธิภาพและ LOD ของแต่ละการทดสอบ | สิ่งสำคัญ | | __Data Analysis__ | | | โปรแกรมการวิเคราะห์ QPCR (แหล่งข้อมูล, เวอร์ชัน) | สิ่งสำคัญ | | การกำหนดวิธีการ CQ | สิ่งสำคัญ | | การระบุและการจัดการผิดปกติ | สิ่งสำคัญ | | ผลลัพธ์ของ NTCs | สิ่งสำคัญ | | เหตุผลของจำนวนและทางเลือกของยีนอ้างอิง | สิ่งสำคัญ | | คำอธิบายของวิธีการ Normalization | สิ่งสำคัญ | | จำนวนและความสอดคล้องของการทำซ้ำทางชีวภาพ | เป็นที่ต้องการ | | จำนวนและระยะ (RT หรือ qPCR) ของการทำซ้ำทางเทคนิค | สิ่งสำคัญ | | อัตราการทำซ้ำ (ความแปรผันภายในการวิเคราะห์) | สิ่งสำคัญ | | ความสามารถในการทำซ้ำ (ความแปรผันภายในการวิเคราะห์ %CV) | เป็นที่ต้องการ | | Power analysis | เป็นที่ต้องการ | | วิธีการทางสถิติสำหรับนัยสำคัญของผลลัพธ์ | สิ่งสำคัญ | | ซอฟต์แวร์ (ต้นฉบับ, เวอร์ชัน) | สิ่งสำคัญ | | การส่งข้อมูล CQ หรือข้อมูลดิบโดยใช้ RDML | เป็นที่ต้องการ | ลิขสิทธิ์ทางเคมีคลินิก 2009 โดย American Association for Clinical Chemistry Inc. ทำซ้ำโดยได้รับอนุญาตจาก American Association for Clinical Chemistry Inc. ในรูปแบบการโพสต์ทางอินเทอร์เน็ตผ่านศูนย์การกวาดล้างลิขสิทธิ์ ขข้อมูลสำคัญทั้งหมดต้องส่งพร้อมกับต้นฉบับควรส่งข้อมูลที่ต้องการหากมี หากไพรเมอร์มาจาก RTPrimerDB ข้อมูลเกี่ยวกับเป้าหมาย qPCR, oligonucleotides, โปรโตคอลและการตรวจสอบสามารถดูได้จากแหล่งดังกล่าว คการประเมินว่าไม่มีดีเอ็นเอโดยใช้การวิเคราะห์การถอดสคริปต์แบบไม่มีการคัดกรองเป็นสิ่งสำคัญเมื่อทำการแยก RNA เป็นครั้งแรก เมื่อตัวอย่างได้รับการตรวจสอบว่าเป็นดีเอ็นเอฟรีการรวมการควบคุมการถอดสคริปต์ที่ไม่มีการตรวจสอบเป็นที่พึงปรารถนาแต่ไม่จำเป็นอีกต่อไป dการเปิดเผยลำดับการตรวจสอบเป็นที่ต้องการอย่างมากและเป็นการส่งเสริมอย่างมาก อย่างไรก็ตามเนื่องจากผู้ให้บริการการวิเคราะห์ที่ออกแบบไว้ล่วงหน้าไม่ได้ให้ข้อมูลนี้จึงไม่สามารถเป็นข้อกำหนดที่สำคัญได้ การใช้การวิเคราะห์ดังกล่าวไม่ได้รับการสนับสนุน ## วัสดุ ขออภัย เกิดข้อผิดพลาดที่ไม่คาดคิด Response not successful: Received status code 500 ### ข้อมูลอ้างอิง 1\. Benes V, Castoldi M. 2010. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50(4):244-249. [https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2010.01.026](https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2010.01.026) 2\. Nolan T, Bustin SA. 2013. PCR Technology: Current Innovations. 3. CRC Press: 3\. Chen C. 2005. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Research. 33(20):e179-e179. [https://doi.org/10.1093/nar/gni178](https://doi.org/10.1093/nar/gni178) 4\. Shi R, Chiang VL. 2005. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. BioTechniques. 39(4):519-525. [https://doi.org/10.2144/000112010](https://doi.org/10.2144/000112010) 5\. Tang F. 2006. MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells. Nucleic Acids Research. 34(2):e9-e9. [https://doi.org/10.1093/nar/gnj009](https://doi.org/10.1093/nar/gnj009) 6\. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1(3):1559-1582. [https://doi.org/10.1038/nprot.2006.236](https://doi.org/10.1038/nprot.2006.236) 7\. Bustin SA. 2010. Why the need for qPCR publication guidelines??The case for MIQE. Methods. 50(4):217-226. [https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.12.006](https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.12.006) 8\. Huggett J, Bustin SA. 2011. Standardisation and reporting for nucleic acid quantification. Accred Qual Assur. 16(8-9):399-405. [https://doi.org/10.1007/s00769-011-0769-y](https://doi.org/10.1007/s00769-011-0769-y) 9\. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, et al. 2009. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. 55(4):611-622. [https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797](https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797) 10\. Huggett JF, Foy CA, Benes V, Emslie K, Garson JA, Haynes R, Hellemans J, Kubista M, Mueller RD, Nolan T, et al. 2013. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. 59(6):892-902. [https://doi.org/10.1373/clinchem.2013.206375](https://doi.org/10.1373/clinchem.2013.206375) __บทความที่เกี่ยวข้อง__ - [How qPCR Works](https://www.sigmaaldrich.com/TH/en/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/how-qpcr-works) - [การออกแบบการวิเคราะห์ PCR/qPCR/dPCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/protocol/genomics/pcr/pcr-qpcr-dpcr-assay-design) - [การเพิ่มประสิทธิภาพและการตรวจสอบการวิเคราะห์ PCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/assay-optimization-and-validation) - [การแก้ไขปัญหา RT-PCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/troubleshooting) - [การแก้ไขปัญหาการขยาย PCR และ RT-PCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/pcr/troubleshooting-pcr-and-rt-pcr-amplification) - [การวิเคราะห์ข้อมูล PCR/QPCR](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/data-analysis) - [โพรบที่มีการติดฉลากคู่](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/dual-labeled-probes) - [การออกแบบสีรองพื้นและโพรบ](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/technical-documents/technical-article/genomics/qpcr/primer-and-probe-design) - [View More](https://www.sigmaaldrich.com/TH/th/search/facet-search?focus=sitecontent&term=facet-search) บนสุด __เข้าสู่ระบบเพื่อดำเนินการต่อ__ เพื่ออ่านต่อ โปรดเข้าสู่ระบบหรือสร้างบัญชีใหม่ เข้าสู่ระบบ__ยังไม่มีบัญชีใช่หรือไม่?__ลงทะเบียน หน้านี้ได้ถูกแปลโดยเครื่องแปลภาษาเพื่อความสะดวกของลูกค้าของเรา เราได้พยายามเพื่อให้มั่นใจว่าเครื่องแปลภาษาแปลได้ถูกต้องแม่นยำ อย่างไรก็ตาม เครื่องแปลภาษานั้นไม่สมบูรณ์แบบ หากคุณไม่พอใจกับเนื้อหาที่แปลโดยเครื่องแปลภาษา โปรดอ้างอิงจากฉบับภาษาอังกฤษ An unknown error has occured.