大分子 HPLC

反相生物大分子 HPLC

反相 HPLC (RP-HPLC) 是一種靈敏且多用途的技術，可用於分離和分析蛋白質、蛋白質片段和多肽。RP-HPLC 使用非極性固定相和極性流動相。蛋白質和勝肽在固定相上的保留遵循吸附和分離原理。疏水性蛋白區域會可逆轉地吸附在固定相上。增加流動相的非極性可洗脫蛋白質。解析度會受到孔徑、粒度、色譜柱長度以及固定相上附著的碳氫鏈的影響。

尺寸排阻色譜 (SEC)

尺寸排阻色譜 (SEC) 是一種非變性色譜模式，可依分子尺寸（即流動半徑）分離分子。此模式不依賴分析物與固定相的互動，而是分析物隨機流經固定相顆粒。高分子量的分析物會較早洗脫，因為它們會完全或部分被固定相顆粒的孔隙排除，而低分子量的分析物則會較遲洗脫，因為它們會花更多的時間在通過顆粒的曲折路徑上。SEC 已經用於表徵單克隆抗體 (mAbs) 聚集體和片段、估計未知蛋白質分子量以及確定蛋白質配方的穩定性。

疏水作用色譜 (HIC)

疏水作用色譜 (HIC) 是一種色譜模式，可根據疏水分析物分子與疏水固定相配體之間的相互作用程度來分離分析物。由於縮氨酸的分子量較低，折疊傾向也較低，因此 HIC 通常不會用於縮氨酸的分離。在高濃度鹽中，蛋白質水合層可能會被破壞到足以讓疏水表面區域與非極性固定相接觸。鹽的選擇由 Hofmeister 系列決定，該系列根據陽離子和陰離子破壞蛋白質水合層 (混沌向性) 或促進蛋白質水合層形成 (混沌向性) 的能力進行分類。典型的鹽類包括硫酸銨、硫酸鉀和硫酸鈉。疏水作用色譜法目前可用於確定抗體藥物結合物 (ADC) 的藥物與抗體比率 (DAR) 狀況。

離子交換色譜法 (IEX)

離子交換色譜法 (IEX) 是一種以電荷分離分析物的色譜模式。蛋白質和縮氨酸是兩性的，這意味著它們同時具有酸性和鹼性功能。酸性蛋白功能性包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和 C 末端的 α-羧酸。基本蛋白功能包括精氨酸、組氨酸、賴氨酸和 N 端的 α-胺。生物治療的電荷變異可透過 IEX 檢測和解析。電荷變異可能來自信使 RNA (mRNA) 謄本的錯誤翻譯和/或翻譯後的修飾，例如脫氨基、氧化或糖基化。

必須根據分析物的等電位 (pI) 來選擇 IEX 色譜柱。 如果流動相的 pH 值低於 pI，分析物將帶正電荷，並與陽離子交換色譜柱結合。

Affinity Chromatography

親和層析依靠分析物與固定相配體之間的特定互動。理想情況下，只有感興趣的分析物質與固定相接觸，其他所有樣品成分都能通過色譜柱。

蛋白 A 層析是生物製藥產業中最常見的親和層析方式。 蛋白 A 是一種 42 kDa 的表面蛋白，存在於金黃色葡萄球菌 (S. aureus) 的細胞壁中。這種蛋白可與 IgG 的 Fc 區域中的重鏈特異性結合，是從其他樣品成分中分離出 IgG 的理想機制。 大多數蛋白質 A 色譜柱的製造過程是將蛋白質固定在多孔的有機微粒上。 不過，目前已製造出蛋白質 A 色譜的整體式色譜柱，可在不降低效率的前提下，以各種流速獲得高樣品通量。