小分子 HPLC

小分子的 HPLC

小分子的 HPLC 分析最常在反相分離模式下進行。對於極性化合物的分離，親水作用色譜 (HILIC) 和正相色譜也很適合，其中 HILIC 是首選的方法。對於離子化合物的分離，可採用離子交換分離模式，對於無機負離子或陽離子，也可採用離子色譜法。

HPLC色譜柱由全多孔矽石顆粒、表面多孔矽石顆粒、聚合物顆粒填裝，或由 monolithic silica 棒作為固定相。此外，還使用氧化鋁、氧化鋯微粒和碳微粒。用於小分子分離的固定相材料的典型孔徑在 60 Å - 160 Å 之間。對於 HPLC，固定相的典型粒徑範圍為 3 µm 至 5 µm，對於 UHPLC，則使用較小的粒徑，通常為 2 µm 或以下。固定相上可附加不同的色譜柱選擇性 (修飾)。C18 烷基鏈是反相 (RP) 色譜中最常用的柱化學物。然而，其他修飾，如 C30、C8、Phenyl、Pentaflourophenyl 和各種更極性的修飾，以及具有離子交換或手性特性的修飾，幾乎可以分離所有溶於液體的化合物。RP-HPLC 的流動相通常由水緩衝液或水與乙腈或甲醇等水溶性有機溶劑組成。

HPLC 樣品製備

複雜且富含基質的樣品，如食品、飲料、化妝品、生物樣品和富含基質的藥品配方（如膏霜、糖漿），需要高效的樣品製備方案來去除不需要的成分，並選擇性地萃取所需的分析物質。如果固定相的粒度非常小，就像超高效液相色譜（UHPLC）中使用的 2 µm 或以下的微粒，這一點就非常重要。常見的樣品製備方法有液液萃取、固相萃取 (SPE)，對於生物樣品還可使用過濾旁的蛋白沉澱法。除了目標化合物的選擇性洗脫與預濃縮之外，樣品製備的主要目的是保護 HPLC 固定相不受樣品基質的阻塞。HPLC 柱基於 monolithic silica可以在很大程度上耐受基質，而且所需的樣品製備比顆粒狀色譜柱少得多。

衍生化

對於某些分子，需要在 HPLC 分離前（柱前）或柱後（柱後）進行衍生化。衍生化可將分子轉換成其衍生物，以提高 HPLC 的靈敏度或色相保留度。具有理想物理和化學特性的化學試劑可用於所需的衍生化。