mRNA 疫苗與治療藥物的製造策略
從研發到臨床試驗的週期大幅縮短，mRNA 技術展現出巨大潛力，不僅能作為應對傳染病爆發的快速有效手段，更能用於開發新型療法，以解決尚未滿足的臨床需求。mRNA 技術具備多重優勢：卓越的安全性、高度的靈活性，以及基於模板的製造流程。
隨著 mRNA 疫苗的早期成功，當今的 mRNA 製造商正致力於透過提升 mRNA 穩定性，並實施改善 pDNA 與 mRNA 純化及擴大規模至 GMP 生產的策略，以提升生產流程的效率與產能。
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章節概述
mRNA 製造的考量要點
mRNA 疫苗及治療藥物的製造通常遵循一套標準化流程（圖 1）。此簡化製造模板針對任何目標均使用相同的反應原料，使 mRNA 製造商能在僅需最小程度的製程調整下，生產新的目標分子。
圖 1.mRNA 製造的一般流程概述。
若干關鍵決策對製程、產量及最終 mRNA 產品的品質具有極大影響，其中之一便是製程化學品與原料的品質。特別是在體外轉錄及後續純化過程中，mRNA 處於未受保護的狀態，面臨極高的酶解降解風險。使用經過內切酶活性檢測且確認無此活性的高品質化學品，可將 RNase 誘導的降解風險降至最低，並在 mRNA 藥品的純化與製劑化過程中提升 mRNA 的穩定性。
本網頁將透過 소개我們專為简化 mRNA 製造流程而設計的全面整合解決方案，協助您應對上述及其他課題。我們的手冊《mRNA 製造用製程化學品》提供了您做出明智選擇所需的詳細信息。
圖 2.mRNA 結構。
- 序列 5’ 端的帽區：對於 mRNA 的成熟、被核醣體識別以進行高效的蛋白質翻譯，以及防止被核酸酶消化以提高穩定性，皆至關重要。
- 位於 mRNA 編碼區上游及下游的未翻譯區 (UTRs)：調節 mRNA 的翻譯、定位與穩定性；可用於提高蛋白質表達效率。
- 開放 reading frame 或編碼序列區：包含目標基因（GOI）。
- 多聚腺苷酸（Poly(A)）尾：透過防止 3’ 外切酶的消化作用，對蛋白質翻譯及 mRNA 穩定性至關重要。
製備 mRNA
基於mRNA的治療药物与疫苗的生产，始于质体DNA（pDNA）模板，该模板经线性化后转录为mRNA。
- 質體DNA（pDNA）製備： pDNA模板包含DNA依賴性RNA聚合酶啟動子及mRNA構建体的序列。pDNA在細菌細胞內進行擴增，隨後收集並裂解細胞以釋放環狀pDNA。此裂解液因含有pDNA及其他大型帶負電荷的雜質（如RNA、基因組DNA及來自細菌細胞的內毒素）而極具黏稠性，這使得純化過程極具挑戰性。
- pDNA 純化：在純化 pDNA 模板時，必須在最大限度分離的同時，盡量減少對質體模板造成機械性損傷的風險。 純化的環狀 pDNA 隨後會被線性化，以避免轉錄穿透現象，此現象可能產生需去除的不希望出現的 mRNA 序列變異體。1 此線性化的 pDNA 模板會進一步純化，以去除諸如用於線性化的限制性酶、牛血清白蛋白 (BSA)、DNA 片段及內毒素等雜質。 由於 pDNA 模板通常在細菌細胞中生產，內毒素雜質是會影響後續純化步驟的關鍵雜質。可使用 Deviron® C16 洗滌劑等清潔劑有效去除內毒素，此類清潔劑是傳統清潔劑的永續、可生物降解且符合 REACH 規範的替代方案。2
在試管規模與 GMP 規模的 pDNA 純化方法存在差異。試管規模的製程常採用溶劑萃取技術分離 pDNA 與其他成分，但大規模處理及處置化學品可能遇到困難。相較之下，GMP 規模則常採用切向流過濾（TFF）與層析法高效去除雜質。
體外轉錄 (IVT)：經線性化與純化的 pDNA，隨後透過酶促反應轉錄為 mRNA。
- 體外轉錄的關鍵組分包括：催化 DNA 轉錄為 mRNA 的 RNA 聚合酶；作為 mRNA 構建單元的核苷三磷酸（rNTPs）；可提高 mRNA 產量的無機焦磷酸酶（IPP）；以及防止 RNA 降解的 RNase 抑制劑。 轉錄緩衝液通常含有二硫蘇糖醇（DTT），用於還原二硫鍵並抑制核糖核酸酶活性；同時加入精胺以提高轉錄效率並穩定核酸。為將此關鍵製程步驟中的酶解降解風險降至最低，必須選用已通過內切酶活性檢測的化學品。 如需全面了解我們的高品質化學品與輔料（包括廣泛的無內切酶產品系列），請參閱 우리의 제품 안내서《mRNA 약물 제조용 공정 화학품》.
- 轉錄監測：在體外轉錄（IVT）反應過程中，應監測關鍵製程參數（CPPs），以控制關鍵品質屬性（CQAs）並確保最佳製程效果。有效的監測能實現更受控的生產，並對製程變異性做出更迅速的反應。
加帽：轉錄完成後，會在 mRNA 轉錄本上添加 5’ 帽結構，以提升其在宿主細胞中的穩定性與轉導效率。加帽可透過兩種方式進行：
- 同步加帽：在IVT步驟中進行。然而，此方法的效率與產率較低，且可能因錯誤結合或反向整合而產生未加帽的雜質。
- 酶促加帽（或稱翻譯後加帽）則在mRNA純化後進行。此方法通常利用加帽酶將帽結構添加至純化的mRNA上。 although this method is more efficient, it is more expensive and adds an additional step after purification.
mRNA 的純化
經體外轉錄後，需將mRNA從前一步驟所使用的雜質及材料中純化出来，包括内毒素、具免疫原性的双股RNA（dsRNA）、残留DNA模板、RNA聚合酶及元素杂质。针对mRNA的纯化与残留DNA的去除，有多种方法可供选择。
透過色譜分離技術，例如反相離子對色譜（IPRP）、陰離子交換色譜（AEX）以及利用聚（dT）捕獲的親和色譜（AC）（圖 3），可有效純化目標 mRNA 並去除 DNA 模板，從而無需進行 DNA 消化1, 3。此外，在酶促加帽反應後，亦會運用色譜技術去除不需要的 mRNA 轉錄本及寡核苷酸雜質。
圖 3：反相離子對色譜、陰離子交換色譜與親和色譜在 mRNA 純化中的比較（DBC：動態結合容量）。4,5
- 反相離子配對 (IPRP) 可在小規模應用中有效捕獲目標單股 RNA (ssRNA) 並將其與雜質分離。然而，由於此方法需要使用溶劑，因此較不適合用於 GMP 製造，且更適合用於後處理而非捕獲。
- 陰離子交換（AEX）色譜法具有高動態結合容量，能有效去除雙股RNA（dsRNA）、無帽RNA、RNA–DNA雜合體以及髮夾mRNA等其他RNA結構。 although AEX uses aqueous solutions, it requires potentially toxic denaturants and operates at temperatures up to 85 °C to elute large mRNA molecules bound to the resin.
- 親和層析（AC）聚(dT)捕獲法利用樹脂特異性捕獲全長mRNA轉錄本的聚(A)尾。此方法能有效去除DNA、核苷酸、酶、緩衝液成分以及任何不具聚(A)尾的雜質。因此，AC通常用於初始mRNA捕獲，隨後以AEX進行精製。
- 在完成色譜步驟後，會進行最終濃縮與透析，以最大化產物純度，並將 mRNA 轉移至適用的緩衝液中，以便進行製劑化或儲存。
規模擴大時的考量
對於擁有大量目標產品管線的製造商而言，一次性技術具備可擴展性、適應性及品質保障，更是許多 mRNA GMP 製造製程的關鍵推動力。GMP 製造利用 TFF 或色譜步驟的優勢進行高效的大規模分離，取代了小規模製程開發中常見的替代性純化方法。需注意的考量事項包括：
- TFF 或色譜步驟取代了 mRNA 製程開發中經常使用的溶劑萃取和沉澱步驟。
- 應盡可能使用高品質化學品及無內切酶試劑，以提升 mRNA 穩定性並將 mRNA 降解的可能性降至最低。
近年來，mRNA 疫苗已成功推廣至廣大患者群體。儘管仍 faced 諸多 challenge，但透過使用高品質化學品與無內切酶試劑來最大化 mRNA 穩定性，並針對色譜純化技術進行優化與客製化以提升分離效率及简化規模放大流程，這些努力已為 GMP 製造範本 bring 重大進展。
為了讓 mRNA 技術發揮其最大潛力，我們需要透過創新解決方案、專業知識與巧思，確保穩健的平台能發展至量產規模。憑藉我們的产品、服务及技术专长，我们致力于开发整合式解决方案，以优化您的 mRNA 制造流程。
參考文獻
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