Protocolo PCR estándar

Cómo hacer PCR

Una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) estándar consta de cuatro pasos:

1. Añada los reactivos necesarios o la mezcla maestra y la plantilla a los tubos de PCR.
2. Mezcle y centrifugue.
   *Añadir aceite mineral para evitar la evaporación en un termociclador sin tapa calefactada.
3. Amplificar según los parámetros del termociclador y de los cebadores.
4. Evaluar el ADN amplificado mediante electroforesis en gel de agarosa seguida de tinción con bromuro de etidio.

.

A continuación se presentan estos pasos en mayor detalle junto con los materiales y consejos de selección de reactivos. Se trata de un protocolo básico de PCR que utiliza la ADN polimerasa Taq.

La PCR es una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Pasos de la PCR y componentes esenciales de la PCR

La resolución de problemas de una reacción de PCR implica muchos factores. Vea esta animación para aprender cómo la selección de los componentes adecuados y las condiciones de ciclado para sus necesidades pueden ayudar a lograr resultados óptimos.

.

Encuentre protocolos adicionales para otras polimerasas o técnicas de PCR avanzadas en la sección Protocolos de nuestra Guía de tecnologías de PCR.

Aprenda más sobre la PCR estándar, incluido qué es, en nuestra Página de fundamentos de la PCR.

Reactivos: ¿Qué se necesita para la PCR?

Reactivo utilizado en la PCR	Producto recomendado
Taq ADN polimerasa	Seleccione Taq ADN polimerasa en función de las preferencias del usuario. (Véase la Taq tabla de polimerasas a continuación.)
Agua de grado PCR	Agua reactiva PCR
Primers diluidos a concentración de trabajo	10 µM de existencias de trabajo son suficientes para la mayoría de los ensayos.
Oligos	Oligos personalizados
ADN a amplificar	Proporcionado por el investigador
Pipetas dedicadas
Termociclador	Con varios tamaños de bloques de pocillos o en multiformato
Puntas de pipeta con filtro estériles
Microcentrífuga estéril de 1.Tubos de microcentrífuga con tapón de rosca de 5 mL	Corning® tubos de microcentrífuga con tapón de rosca
Tubos o placas para PCR	Elija el que se adapte a la cicladora:
	Tubos PCR individuales de pared fina de 200 µL
	Tubos en tira de 200 µL
	Placas multipocillo y sello de placa
mezcla de dNTP	mezcla de deoxinucleótidos contiene 10 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP *las mezclas ya incluyen dNTPs

¿Qué es la Taq Polimerasa?

Taq ADN polimerasa es una enzima termoestable derivada de la bacteria termófila Thermus aquaticus.E. coli. Es capaz de soportar repetidos calentamientos a 95 °C (como exige la técnica PCR) sin pérdida significativa de actividad. La enzima tiene un peso molecular de aproximadamente 94 kDa por SDS-PAGE sin actividad endonucleasa o exonucleasa detectable. Tiene actividad ADN polimerasa 5'→3' y actividad exonucleasa 5'→3'. Cada lote de Taq polimerasa de ADN se prueba para amplificación por PCR y secuenciación bicatenario. La enzima se suministra a 5 unidades/µL y viene con un tampón de reacción 10x optimizado.

Estándar Taq Polimerasa de ADN./i>ADN polimerasa

Utilice la tabla siguiente para seleccionar una mezcla adecuada de Taq ADN polimerasa para sus condiciones de reacción. Elija entre formulaciones transparentes o teñidas de rojo con y sin cloruro de magnesio (MgCl₂) o una mezcla preparada o una mezcla maestra con tampón y dNTPs.

PolimerasaTaq.

Conteniendo MgCl2		Separa MgCl2	Readymix                     &nbspnbsp;
Formulación transparente sin colorante	Con colorante rojo para carga directa en geles	Formulación transparente sin colorante	Con colorante rojo para carga directa en geles	Formulación transparente sin colorante
Taq ADN Polimerasa de Thermus aquaticus (D1806)	REDTaq® ADN Polimerasa (D4309)	Taq® ADN Polimerasa (D4309)	TaqTaq ADN Polimerasa de Thermus aquaticus, sin MgCl2 (D4545)	REDTaq® ReadyMix™ PCR Reaction Mix (R2523)	ReadyMix™ Taq PCR Reaction Mix (P4600)

Definición de la unidad: Una unidad incorpora 10 nmol de desoxirribonucleósido trifosfato total en ADN precipitable en ácido en 30 minutos a 74 °C.

Procedimiento: Pasos de la PCR

Las condiciones óptimas para la concentración de Taq ADN polimerasa, ADN molde, cebadores y MgCl₂ dependerán del sistema que se utilice. Puede ser necesario determinar las condiciones óptimas para cada componente individual. Esto es especialmente cierto para la Taq ADN polimerasa, los parámetros de ciclado y la concentración de MgCl₂. Se recomienda valorar la enzima y el MgCl₂ para determinar la eficacia óptima.

1. Agregue los reactivos a un tubo de tamaño adecuado en el orden indicado en la tabla. (Seleccione la tabla adecuada para la configuración de la reacción: reactivo estándar o readymix.) Para un gran número de reacciones, debe prepararse una mastermix sin la plantilla y alicuotar en los tubos de reacción. Al final, la plantilla debe añadirse a los tubos apropiados.
   

Reacción PCR estándar

Cantidad	Componente	Concentración final
w µL	Agua
5 µL	Tampón PCR 10x (P2192< or P2317)*	1x
1 µL	Mezcla de deoxinucleótidos	200 µM
w µL	Imprimador hacia delante (normalmente de 15-30 bases de longitud)	0.1-0.5 µM
x µL	Imprimador inverso (normalmente de 15-30 bases de longitud)	0.1-0,5 µM
0.5 µL	Taq ADN Polimerasa*	0.05 unidades/µL
y µL	ADN modelo (normalmente 10 ng)	200 pg/µL
z µL	25 mM MgCl2 (utilizar sólo con tampón P2317)	0.1-0.5 mM
50 µL	Volumen total de reacción

*Comprar tampón y Taq polimerasa juntos: D1806, D4309 o D4545

Reacción PCR Readymix

Reacción PCR Readymix.

Cantidad	Componente	Concentración final
25 µL	Readymix (R2523 o P4600)
w µL	Imprimador hacia delante (normalmente de 15-30 bases de longitud)	0.1-0.5 µM
x µL	Imprimador inverso (normalmente de 15-30 bases de longitud)	0.1-0.5 µM
y µL	ADN modelo (normalmente 10 ng)	200 pg/µL
z µL	Agua
50 µL	Volumen total de reacción

2. Mezclar suavemente mediante vórtex y centrifugar brevemente para recoger todos los componentes en el fondo del tubo.

Nota: añadir 50 µl de aceite mineral en la parte superior de cada tubo para evitar la evaporación si se utiliza un termociclador sin tapa calefactada.

3. Amplificar. Los parámetros de amplificación variarán en función de los cebadores y del termociclador utilizado. Puede ser necesario optimizar el sistema para los cebadores, la plantilla y el termociclador individuales.

Parámetros de ciclado típicos

Se recomiendan de 25 a 30 ciclos de amplificación.

Se recomiendan de 25 a 30 ciclos de amplificación.

Paso PCR	Temperatura °C	Duración
Plantilla de temperatura	94 °C	1 min
Anneal primers	1 min.55 °C	2 min
Extensión	72 °C	3 min

4. El ADN amplificado puede evaluarse mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior tinción con bromuro de etidio.

      Nota: La superposición de aceite mineral puede eliminarse mediante una única extracción con cloroformo (1:1), recuperando la fase acuosa.

Reactivos para electroforesis de ácidos nucleicos

• Agarosa (geles prefabricados, polvo, etc.)
• Tampón como MOPS-EDTA-acetato de sodio, tris-acetato-EDTA (TAE) o tris-borato-EDTA (TBE)
• Solución de carga del gel y tampón de carga de la muestra.Solución de carga de gel y tampón de carga de muestras para ARN
• Tinte o colorante de electroforesis como bromuro de etidio

Solución de carga de gel y tampón de carga de muestras para ARN.

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

Declaración de licencia

NOTA AL COMPRADOR: RENUNCIA A LA LICENCIA

Con la compra de este producto no se concede licencia alguna en virtud de ninguna de las patentes US Nos. 5,804,375, 5,994,056, 6,171,785, 6,214,979, 5,538,848, 5,723,591, 5,876,930, 6,030,787, y 6,258,569, y las patentes correspondientes fuera de los Estados Unidos, o cualquier otra patente o solicitud de patente, relacionada con los procesos de nucleasa 5' y colorante de unión a dsADN. Para más información, póngase en contacto con el Director de Licencias, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, EE.UU.

.

Materiales

Lo sentimos, se ha producido un error inesperado

Response not successful: Received status code 500