Protocolo de inmunoelectrotransferencia, inmunotransferencia Western o Western Blotting

La inmunoelectrotransferencia se refiere a la transferencia electroforética de proteínas desde geles de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio hasta membranas de PVDF o nitrocelulosa, seguida de la inmunodetección de las proteínas utilizando anticuerpos con detección fluorescente o quimioluminiscente. 

Etapas del procedimiento de trabajo de la inmunoelectrotransferencia

1. Preparación de la muestra: lisis celular y extracción de proteínas
2. Electroforesis en gel de SDS-PAGE
3. Transferencia a la membrana
   a) Transferencia en tanque
   b) Transferencia semiseca
4. Inmunodetección
   a) Inmunodetección tradicional
   b)Protocolo de inmunodetección de 30 minutos utilizando el sistema SNAP i.d.^®
   
5. Guía de resolución de problemas

Protocolo de transferencia a membrana (transferencia en tanque)

Materiales

• Papel secante
• Membrana de transferencia (por ejemplo, membranas de PVDF Immobilon^®
• Tampón de transferencia
• Metanol, etanol o isopropanol
• Sistema de transferencia en tanque (por ejemplo, sistema de SB10 OmniPage de minielectrotransferencia)
• Fuente de alimentación
  

Montaje

1. Prepare suficiente tampón de transferencia para llenar el tanque de transferencia además de otros 200 ml para equilibrar el gel y la membrana, y humedezca el papel de filtro.
   
2. Saque el gel de su caja; recorte el gel concentrador y los pocillos.
   
3. Sumerja el gel en el tampón de transferencia durante 10 a 30 minutos.
   
4. Remoje los papeles de filtro en el tampón de transferencia durante al menos 30 segundos.
   
5. Prepare la membrana:
   
       a. Si está utilizando una membrana de PVDF, humedezca la membrana en metanol durante 15 segundos. La membrana debe cambiar uniformemente
           de opaca a semitransparente.
       b. Coloque con cuidado la membrana en agua Milli-Q^® y remoje durante 2 minutos.
       c. Coloque con cuidado la membrana en el tampón de transferencia y deje equilibrar durante al menos 5 minutos.

Montaje de la pila de transferencia

1. Abra el portacajas.
   
   Importante : para garantizar una transferencia uniforme, retire las burbujas de aire que hayan quedado entre las capas con unrodillo para membrana de transferencia o haciendo rodar con cuidado una pipeta o una varilla de agitación sobre la superficie de cada capa en la pila. No aplique presión excesiva para evitar dañar la membrana y el gel.
   
   
2. Coloque una almohadilla de espuma (fibra) en un lado de la caja.
   
3. Coloque una lámina de papel de filtro encima de la almohadilla.
   
4. Coloque el gel encima del papel de filtro.
   
5. Coloque la membrana sobre el gel.
   
6. Coloque una segunda lámina de papel de filtro encima de la pila.
   
7. Coloque la segunda almohadilla de espuma encima del papel de filtro.
   
8. Cierre el portacajas.

Método para transferencia de proteínas (transferencia en tanque)

1. Coloque el portacajas en el tanque de transferencia de modo que el lado del gel del portacajas esté mirando al cátodo (–) y el lado de la membrana esté mirando al ánodo (+).
   
2. Agregue el tampón adecuado en el tanque hasta cubrir el portacajas.
   
3. Introduzca el cable del cátodo negro (–) en el conector del cátodo y el cable del ánodo rojo (+) en el conector del ánodo en la unidad de transferencia.
   
4. Conecte el cable del ánodo y el cable del cátodo a sus salidas de potencia correspondientes.
   
5. Si está disponible, configure la unidad de refrigeración de la unidad de transferencia del tanque de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   
6. Encienda el sistema durante 1 a 2 horas a una distancia interelectrodos de 6 a 8 V/cm. Para detalles de optimización, siga las directrices del fabricante del tanque.
   
7. Una vez completada la transferencia, retire el portacajas del tanque.
   
8. Utilizando pinzas, desmonte cuidadosamente la pila de transferencia.
    

Consejos para una transferencia Western Blotting correcta

• En ambos tipos de sistemas de transferencia (tanque y semiseco), hay que tener especial cuidado para evitar la introducción de burbujas de aire en cualquier lugar entre el papel de filtro, el gel o la membrana. 
• Transfiera las proteínas a corriente constante. Si se hace la transferencia a voltaje constante, controle la corriente para tener la certeza de que no supera los 0,4 amperios. Comience a partir de 100 V y reduzca el voltaje si la corriente es demasiado alta
  
• Los geles más gruesos o las proteínas más grandes pueden requerir tiempos de transferencia más largos o una mayor fuerza de campo. Las condiciones de transferencia reales deben optimizarse para cada sistema.
• Ambos lados de las membranas de transferencia Immobilon® funcionan igual de bien. El aspecto de cualquiera de los lados (brillante u opaco) no tiene efecto en el rendimiento de la transferencia ni de la detección de la membrana.
• Para las muestras que contienen péptidos pequeños, el equilibrado del gel en el tampón de transferencia debe limitarse a menos de 10 minutos.
• Utilice Immobilon® PSQ para obtener la máxima retención cuando una proteína de interés sea de 20 kDa o inferior.
• Utilice la membrana de transferencia Immobilon®-FL para los métodos de detección fluorescente.
• Los geles se pueden transferir individualmente o varios geles pueden transferirse en una única pila.

Protocolo de transferencia semiseca a la membrana

Materiales

• Papel secante
• Membrana de transferencia (por ejemplo, membranas de PVDF Immobilon^®
• Tampón para el ánodo I: Tris 0,3 M, pH 10,4, metanol 10 % (v/v).
• Tampón para el ánodo II: Tris 25 mM, pH 10,4, metanol al 10 % (v/v).
• Tampón para el cátodo: Tris 25 mM, ácido 6-amino-n-caproico 40 mM (se puede sustituir por glicina), metanol al 10 % (v/v), pH 9,4.
• Sistema para transferencia semiseca (por ejemplo, nº de referenciaB2529)
• Fuente de alimentación

Montaje

1. Prepare 200 ml de cada tampón para el ánodo y 400 ml del tampón para el cátodo.
   
2. Saque el gel de su caja; recorte el gel concentrador
   
3. Sumerja el gel en 200 ml de tampón de cátodo durante 15 minutos.
   
4. Remoje dos piezas de papel de filtro en el tampón de ánodo I durante al menos 30 segundos.
   
5. Remoje un pedazo de papel de filtro en el tampón de ánodo II durante al menos 30 segundos.
   
6. Remoje tres trozos de papel de filtro en el tampón de cátodo durante al menos 30 segundos.
   
7. Prepare la membrana:
       a. Humedezca la membrana en metanol durante 15 segundos. La membrana debe cambiar uniformemente de opaca a semitransparente.
       b. Coloque con cuidado la membrana en agua Milli-Q^® y remoje durante 2 minutos.
       c. Coloque con cuidado la membrana en el tampón de ánodo II y deje equilibrar al menos durante 5 minutos.

Para transferencias únicas:

1. Coloque la placa del electrodo de ánodo sobre una mesa de trabajo nivelada.
   
2. Coloque dos piezas de papel de filtro empapadas en el tampón de ánodo I en el centro de la placa.
   
3. Coloque el papel de filtro empapado en el tampón de ánodo II encima de las dos primeras láminas.
   
4. Coloque la membrana encima de los papeles de filtro.
   
5. Coloque el gel encima de la membrana.
   
6. Coloque las tres láminas de papel filtrante empapados en el tampón de cátodo encima de la membrana.
   
7. Coloque la placa del electrodo del cátodo encima de la pila.

Para transferencias múltiples:

1. Coloque la placa del electrodo de ánodo sobre una mesa de trabajo nivelada.
   
2. Coloque dos láminas de papel de filtro empapadas en el tampón de ánodo I en el centro de la placa.
   
3. Coloque el papel de filtro empapado en el tampón de ánodo II encima de las dos primeras láminas.
   
4. Coloque la membrana encima de los papeles de filtro.
   
5. Coloque el gel encima de la membrana.
   Para el último gel, vaya al paso 10.
   
6. Coloque una lámina de papel filtrante empapado en el tampón de cátodo encima del gel.
   
7. Coloque una lámina de membrana de diálisis sobre el papel de filtro.
   
8. Coloque una lámina de papel de filtro empapado en el tampón de ánodo II sobre la membrana de diálisis.
   
9. Repita los pasos 4 a 8 hasta que se hayan incorporado todos los geles en la pila (hasta el máximo de la unidad)..
   
10. Coloque tres láminas de papel filtrante empapados en el tampón de cátodo encima del último gel.
    
11. Coloque la placa del electrodo del cátodo encima de la pila.
    
    IMPORTANTE: no golpee la cubierta de la placa catódica durante el análisis, ya que podría alterar la alineación de la pila de transferencia y causar resultados imprecisos.

Método de transferencia de proteínas (semiseco)

1. Introduzca el cable de cátodo negro (–) en el conector de la placa catódica.
   
2. Inserte el cable de ánodo rojo (+) en el conector de la placa del ánodo.
   
3. Conecte el cable del ánodo y el cable del cátodo a sus salidas correspondientes de la fuente de alimentación.
   
4. Encienda la fuente de alimentación.
   
5. Ajuste la corriente y déjelo correr durante el tiempo indicado en la siguiente tabla:

Tabla 1.Tiempos recomendados para la transferencia semiseca de proteínas

*La superficie (cm²) se calcula a partir de las dimensiones de la pila en la placa del ánodo. Este valor es independiente del número de geles en la pila.

Inmunodetección tradicional

Materiales

• Anticuerpos primarios y secundarios
• Agitador orbital* (N.º de referenciaZ768499)
• Ranuras de 2 a 3 mm de profundidad, ligeramente más grandes que el tamaño de la membrana
• Sustratos de detección (para uso con conjugados de peroxidasa o fosfatasa-anticuerpo)
  - Sustratos de quimioluminiscencia
  -Sustratos cromógenos

*El agitador y las ranuras solo son necesarios para la inmunodetección tradicional; para la inmunodetección rápida, impulsada por vacío utilizando el
sistema SNAP i.d.^®, consulte el protocolo de inmunodetección SNAP i.d.^®.

Incubación de los anticuerpos

1. Coloque la membrana en la disolución de bloqueo e incube con agitación durante 1 hora.
   
2. Coloque la membrana en la disolución de anticuerpo primario, por ejemplo Anticuerpo monoclonal anti-beta-actina e incube con agitación durante 1 hora. La disolución debe moverse libremente por la superficie de la membrana.
   
3. Coloque la membrana en PBS y lave durante 10 minutos. Repita dos veces con tampón reciente.
   
4. Coloque la membrana en la disolución de anticuerpo secundario e incube con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente o 37 °C.
   
5. Coloque la membrana en PBS y lave durante 10 minutos. Repita dos veces con tampón reciente.
   
6. Proceda con la detección cromógena, quimioluminiscente o fluorescente. Vea también los recursos relacionados para la detección de proteínas:
       Detección cromógena y quimioluminiscente de proteínas
      Inmunodetección utilizando sustrato BCIP/NBT

Detección quimioluminiscente

Siga las instrucciones del fabricante.

1. Prepare el sustrato de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   
2. Coloque la membrana en un recipiente y agregue el sustrato hasta cubrir por completo la membrana.
   Incube durante 1 minuto.
   
3. Drene el exceso de sustrato.
   
4. Coloque la membrana en un trozo de vidrio limpio y envuélvalo en papel plástico.
   Nota: también se puede utilizar un protector a medida o una bolsa de congelador.
   
5. Alise suavemente eliminando las burbujas de aire.
   
6. En una habitación oscura, coloque la membrana envuelta en un chasis.
   
7. Coloque una película de autorradiografía encima y cierre el chasis.
   
8. Exponga la película. Para determinar el tiempo de exposición óptimo deben hacerse varias exposiciones de 15 segundos a 30 minutos; 1 a 5 minutos es lo habitual.

Detección fluorescente

Equipo necesario

• Proteínas transferidas a la membrana de transferencia Immobilon^®-FL y probadas con anticuerpos.
  
• Papel plástico Mylar^®.
  
• Equipo de obtención de imágenes fluorescentes.

El siguiente es un protocolo general para la inmunodetección fluorescente. Para obtener resultados óptimos, consulte el protocolo del fabricante proporcionado con los reactivos.

Nota : si utiliza reactivos de la quimiofluorescentes, siga las instrucciones del fabricante del reactivo.

1. Coloque la membrana en una disolución de anticuerpo secundario marcado con colorante fluorescente diluido e incube durante 1 hora con agitación suave.
   
2. Lave la membrana con un tampón de lavado de 3 a 5 veces durante 5 minutos cada uno.
   
3. Coloque la membrana en un trozo de papel de filtro limpio para secar.
   
4. Si utiliza papel plástico, use Mylar^®. No utilice papel plástico Saran™ porque permite que la luz la atraviese y apague la fluorescencia.
   
5. Obtenga la imagen de la membrana usando un escáner de fluorescencia apropiado.

Tabla 2.Guía de resolución de problemas de la inmunoelectrotransferencia