HPLC phân tử lớn

Phân tử sinh học pha đảo ngược HPLC

HPLC pha đảo ngược (RP-HPLC) là một kỹ thuật nhạy cảm và linh hoạt được sử dụng để phân tách và phân tích protein, mảnh protein và peptide. RP-HPLC sử dụng pha tĩnh không phân cực và pha di động cực. Giữ protein và peptide trong giai đoạn cố định tuân theo các nguyên tắc hấp phụ và phân vùng. Các vùng protein kỵ nước gắn đảo ngược vào pha tĩnh. Các protein được tránh bằng cách tăng bản chất không phân cực của pha di động. Độ phân giải có thể bị ảnh hưởng bởi kích thước lỗ rỗng, kích thước hạt, chiều dài cột và chuỗi hydrocarbon gắn vào pha tĩnh.

Size Exclusion Chromatography (SEC)

Sắc ký loại trừ kích thước (SEC) là chế độ sắc ký không biến tính phân tách các phân tử theo kích thước của chúng (tức là bán kính thủy động ). Chế độ này không dựa vào tương tác chất được phân tích với pha tĩnh, mà dựa vào dòng chất được phân tích ngẫu nhiên thông qua các hạt pha tĩnh. Các chất phân tích trọng lượng phân tử cao đã thoát ra sớm hơn, vì chúng được loại trừ hoàn toàn hoặc một phần khỏi các lỗ hạt pha cố định, trong khi các chất phân tích trọng lượng phân tử thấp hơn sẽ thoát ra sau đó, vì chúng dành nhiều thời gian hơn để điều hướng đường xoắn thông qua hạt. SEC đã được sử dụng để mô tả các tập hợp và phân mảnh kháng thể đơn dòng (mAbs), ước tính trọng lượng phân tử protein chưa biết và xác định sự ổn định của công thức protein.

Sắc ký tương tác kỵ nước (HIC)

Sắc ký tương tác kỵ nước (HIC) là một chế độ sắc ký phân tách các chất được phân tích dựa trên mức độ tương tác giữa các chất phân tích kỵ nước và phối tử pha tĩnh kỵ nước. Do trọng lượng phân tử thấp hơn và xu hướng gấp thấp hơn, HIC thường không được sử dụng trong tách peptide. Ở nồng độ muối cao, các lớp hydrat hóa protein có thể bị phá vỡ đủ để các vùng bề mặt kỵ nước giao tiếp với pha tĩnh không phân cực. Chọn lọc muối được quyết định bởi loạt Hofmeister, phân loại cation và anion bởi khả năng phá vỡ các lớp hydrat hóa protein (chaotropic) hoặc thúc đẩy sự hình thành lớp hydrat hóa protein (kosmotropic). Các muối điển hình bao gồm amoni sunfat, kali sulfat và natri sunfat. Sắc ký tương tác kỵ nước hiện đang được sử dụng để xác định hồ sơ tỷ lệ thuốc trên kháng thể (DAR) của liên hợp kháng thể-thuốc (ADC).

Ion Exchange Chromatography (IEX)

Sắc ký trao đổi ion (IEX) là một chế độ sắc ký phân tách các chất được phân tích bằng điện tích. Protein và peptide là chất lưỡng tính, có nghĩa là chúng thể hiện cả chức năng axit và cơ bản. Các chức năng của protein axit bao gồm axit aspartic, axit glutamic, cysteine, tyrosine và α-carboxylate đầu C. Các chức năng protein cơ bản bao gồm arginine, histidine, lysine và N-terminus α-amine. Các biến thể sạc hóa trị liệu sinh học có thể được phát hiện và giải quyết bởi IEX. Các biến thể điện tích có thể phát sinh từ phiên dịch sai RNA thông tin (mRNA) và / hoặc các sửa đổi sau dịch mã, chẳng hạn như khử amidation, oxy hóa, hoặc glycosyl hóa.

Cột IEX phải được chọn dựa trên điểm đẳng điện chất được phân tích (pi).  Nếu pha pH di động thấp hơn pi, chất được phân tích sẽ được tích điện dương và liên kết với cột trao đổi cation.  Nếu độ pH pha di động cao hơn pi, chất được phân tích sẽ được tích điện âm và liên kết với cột trao đổi anion.

Affinity Chromatography

Sắc ký ái lực dựa trên một tương tác cụ thể giữa một chất được phân tích và phối tử pha cố định. Lý tưởng nhất, chỉ chất được phân tích quan tâm giao tiếp với pha tĩnh, cho phép tất cả các thành phần mẫu khác đi qua cột. Một pha di động thứ hai sau đó được đi qua cột để loại bỏ chất được phân tích.

Sắc ký Protein Một hình thức phổ biến nhất của sắc ký ái lực được sử dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm sinh học.  Protein A là một protein bề mặt 42 kDa được tìm thấy trong thành tế bào của S. aureus.  Protein này liên kết đặc biệt với chuỗi nặng trong vùng FC của IgG, làm cho nó trở thành một cơ chế lý tưởng để tách IgG khỏi các thành phần mẫu khác.  Hầu hết các cột protein A được sản xuất bằng cách cố định protein trên một hạt xốp, hữu cơ.  Tuy nhiên, định dạng nguyên khối cho protein sắc ký đã được tạo ra, cho phép thông lượng mẫu cao ở các tốc độ dòng chảy khác nhau, mà không làm giảm hiệu quả.