HPLC phân tử nhỏ

Phân tích HPLC các phân tử nhỏ

Phân tích HPLC các phân tử nhỏ thường được thực hiện ở chế độ tách pha đảo ngược. Đối với việc tách các hợp chất phân cực, sắc ký tương tác ưa nước (HILIC) và sắc ký pha thường cũng phù hợp, trong đó HILIC là phương pháp được ưa chuộng hơn. Đối với việc tách các hợp chất ion, chế độ tách trao đổi ion và đối với các anion hoặc cation vô cơ, sắc ký ion cũng có thể được sử dụng.

Cột HPLC được nhồi bằng các hạt silica xốp hoàn toàn, hạt silica xốp bề mặt, hạt polymer hoặc gồm một thanh silica nguyên khối làm pha tĩnh. Ngoài ra, các hạt oxit nhôm, hạt zirconia và hạt carbon cũng được sử dụng. Kích thước lỗ rỗng điển hình của vật liệu pha tĩnh cho việc tách phân tử nhỏ nằm trong khoảng 60 Å - 160 Å. Đối với HPLC, kích thước hạt điển hình của pha tĩnh nằm trong khoảng từ 3 µm đến 5 µm; đối với UHPLC, các hạt có kích thước nhỏ hơn, thường là 2 µm hoặc nhỏ hơn, được sử dụng. Các tính chọn lọc khác nhau (sửa đổi) có thể được gắn vào pha tĩnh. Chuỗi alkyl C18 là hóa học cột được sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký pha đảo (RP). Tuy nhiên, các biến thể khác, chẳng hạn như C30, C8, Phenyl, Pentaflourophenyl và một loạt các biến thể phân cực hơn cũng như các biến thể có tính chất trao đổi ion hoặc tính chất đối xứng, cho phép tách hầu hết các hợp chất hòa tan trong chất lỏng. Pha động cho RP-HPLC thường bao gồm dung dịch đệm nước hoặc nước và các dung môi hữu cơ hòa tan trong nước như acetonitrile hoặc methanol.

Chuẩn bị
mẫu HPLC

Các mẫu phức tạp và giàu ma trận, chẳng hạn như thực phẩm, đồ uống, mỹ phẩm, mẫu sinh học và các chế phẩm dược phẩm giàu ma trận (ví dụ: kem, xi-rô) đòi hỏi các quy trình chuẩn bị mẫu hiệu quả để loại bỏ các thành phần không mong muốn và chiết xuất có chọn lọc chất phân tích cần quan tâm. Điều này rất quan trọng nếu sử dụng pha tĩnh có kích thước hạt rất nhỏ như trong UHPLC, nơi sử dụng các hạt có kích thước 2 µm trở xuống. Các phương pháp chuẩn bị mẫu phổ biến là chiết xuất lỏng-lỏng, chiết xuất pha rắn (SPE) và đối với mẫu sinh học còn có kết tủa protein bên cạnh lọc. Ngoài việc rửa giải chọn lọc hợp chất mục tiêu và cô đặc trước, mục đích chính của việc chuẩn bị mẫu là bảo vệ pha tĩnh HPLC khỏi bị tắc do ma trận mẫu. Các cột HPLC dựa trên silica nguyên khối có thể chịu được ma trận ở mức độ cao và yêu cầu chuẩn bị mẫu ít hơn nhiều so với các cột hạt. 

Phân giải

Đối với một số phân tử, quá trình dẫn xuất là cần thiết, có thể thực hiện trước (trước cột) hoặc sau (sau cột) quá trình tách HPLC. Quá trình dẫn xuất chuyển đổi các phân tử thành các dẫn xuất của chúng để tăng độ nhạy hoặc cải thiện khả năng giữ lại trên sắc ký HPLC. Các chất hóa học có tính chất vật lý và hóa học phù hợp được sử dụng cho quá trình dẫn xuất cần thiết.