Mẹo & thủ thuật cho sắc ký lớp mỏng
Monika Bäumle, Global Product Manager TLC, Ilona Matus, Analytical Sciences Liaison
Merck
Giới thiệu
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật phân tách nhanh, dễ sử dụng và rất linh hoạt để phân tích định tính và định lượng. Nó lý tưởng để nhận dạng nhanh, sàng lọc và theo dõi phản ứng. Dung sai ma trận cao của nó và khả năng tách nhiều mẫu song song làm cho TLC tiết kiệm thời gian và chi phí cao.
Nguyên tắc hoạt động của TLC
Quá trình sắc ký lớp mỏng nói chung rất đơn giản, tuy nhiên nó bao gồm một loạt các bước và một số biện pháp phòng ngừa cần được xem xét (Hình 1).
Một ví dụ là pha khí trong buồng phát triển, ảnh hưởng đến quá trình TLC. Do đó, điều quan trọng là duy trì các điều kiện khí và độ ẩm được kiểm soát để đạt được hiệu suất tái tạo và kết quả TLC chính xác. Trong những điều sau đây, chúng ta đề cập đến một số khía cạnh quan trọng cần được xem xét ở các bước khác nhau.
Hình 1.TLC process.
Bảo quản và xử lý các tấm TLC
Lớp TLC là các vật liệu có tính hoạt động cao và có thể hấp thụ độ ẩm và chất gây ô nhiễm có nguồn gốc từ môi trường phòng thí nghiệm. Do đó, nên bảo quản các tấm trong môi trường sạch và khô (ví dụ như trong máy hút ẩm). Nếu có thể, hãy bọc các tấm bằng giấy nhôm và giữ chúng tránh xa khói hóa chất và hơi.
Chuẩn bị tấm TLC: Rửa trước (giặt) và Kích hoạt lớp
Chất gây ô nhiễm và hơi ẩm từ môi trường có thể làm thay đổi hiệu suất của tấm, đặc biệt khi không được bảo quản đúng cách sau khi mở gói. Ngoài ra, các tấm có thể có tạp chất từ các chất kết dính, bao bì hoặc xử lý trước đó. Những chất gây ô nhiễm này có thể được loại bỏ bằng cách rửa trước lớp. Điều này có thể được thực hiện bằng cách nhúng chúng vào dung môi (một hoặc hai lần, 1-7 phút) hoặc bằng một lần chạy trống của tấm TLC ví dụ, với methanol. Chú ý đến hướng sắc ký, vì các tạp chất sẽ tập trung ở cạnh trên của tấm.
Để loại bỏ nước liên kết ở các nhóm chức năng cực của pha, nên làm nóng tấm trong 20 – 30 phút ở 120 °C (trong lò nướng sạch) để kích hoạt tấm thích hợp.
TLC Sample Preparation
Các tấm sắc ký lớp mỏng là các thiết bị sử dụng một lần, do đó chúng không chịu nguy cơ lây nhiễm chéo vào phân tích trong tương lai. Do đó, việc chuẩn bị mẫu thường có thể được đơn giản hóa và do đó ít tốn thời gian hơn so với HPLC. Khuyến cáo nên nghiền/đồng nhất mẫu và chiết tách bằng dung dịch pha loãng thích hợp (ví dụ: Đối với các mẫu rắn), cuối cùng theo sau là các bước lọc và nồng độ.
Lựa chọn pha tĩnh trong TLC
Việc lựa chọn pha tĩnh TLC là rất quan trọng vì nó xác định hiệu suất chọn lọc và phân tách. Có rất nhiều lựa chọn - dựa trên silica, nhôm oxit hoặc cellulose, sửa đổi hoặc không sửa đổi. Lựa chọn phải liên quan đến các thuộc tính của mẫu và mục tiêu ứng dụng của bạn. TLC có thể được chạy ở hai chế độ, chế độ pha bình thường và đảo ngược. Trong chế độ pha bình thường (NP), pha di động ít phân cực hơn pha tĩnh trên tấm TLC, trong khi trong pha đảo ngược (RP), pha di động có cực hơn pha tĩnh. Hơn 80% tất cả các phân tách TLC được thực hiện trên silica gel như pha tĩnh, hoặc trần hoặc sửa đổi với ví dụ C18.
Làm thế nào để chọn Hệ thống Dung môi cho TLC?
Sự lựa chọn pha di động trong TLC là một yếu tố quan trọng khác cho kết quả tách hiệu quả. Dung môi hòa tan các thành phần mẫu trên lớp hấp thụ và di chuyển chúng qua tấm. Các giai đoạn di động lý tưởng vận chuyển tất cả các thành phần từ đường cơ sở có giá trị R F (hệ số duy trì) cuối cùng từ 0,15 đến 0,85 (lý tưởng là 0,2 - 0,6). Hệ số duy trì được định nghĩa là khoảng cách di chuyển của chất chia cho khoảng cách di chuyển của dung môi. Thông thường, chúng cũng được mô tả là hRF, được định nghĩa là 100x RF. Khi một phương pháp được phát triển từ đầu, điển hình là hỗn hợp của một dung môi phân cực và không phân cực được sử dụng làm điểm khởi đầu. Để tăng giá trị R F trong NP-TLC, cần phải tăng phân cực của pha di động. Trong trường hợp cần giảm R F, cần phải giảm phân cực. Một hệ thống pha di động rất phổ biến trong NP-TLC chứa hexane và 10 – 50% ethyl acetate (EtOAc). Các hệ thống dung môi nổi bật khác dựa trên metanol và dichloromethane, toluene hoặc acetone. Trong RP-TLC, các hệ thống dung môi thường là hỗn hợp dựa trên nước, metanol, acetonitrile hoặc bộ đệm nước.
Các dung môi và hỗn hợp dung môi được sử dụng phải có độ tinh khiết và ổn định đầy đủ, độ nhớt thấp, áp suất hơi thấp và độc tính thấp, nếu có thể.
Việc bổ sung các điều chỉnh nhất định (cơ bản hoặc axit) có thể cải thiện kết quả phân tách.
Một cách tiếp cận có hệ thống chi tiết để tìm ra các hệ thống dung môi lý tưởng có thể được tuân theo dựa trên dữ liệu đã công bố.1
Sample Application
Mẫu có thể được áp dụng dưới dạng đốm hoặc dải bằng cách tiếp xúc hoặc phun. Ứng dụng lấy mẫu bằng cách phun vào một dải cho phép cải thiện kết quả phân tách và là phương pháp được ưu tiên khi có khối lượng mẫu lớn hơn. Có sẵn thiết bị đặc biệt để phun dung dịch mẫu lên tấm. Phương pháp này tránh tiếp xúc trực tiếp với lớp TLC và thường được sử dụng cho ứng dụng băng tần.
Độ phân cực của mẫu pha loãng là một yếu tố cần được xem xét. Trong NP-TLC, các chất pha loãng không phân cực được sử dụng, như n-hexane, đảm bảo rằng các chất vẫn còn ở điểm áp dụng. Tuy nhiên, với nhiều chất pha loãng cực hơn (ví dụ toluene, dichloromethane, methanol), các chất mẫu được vận chuyển về phía rìa của "vùng ướt" (điểm ở vạch xuất phát), và thường tạo thành một điểm sắc ký tròn ở khu vực bắt đầu (xem trên hình 2). Giống như trong phát triển sắc ký học, các đỉnh với sự phân bố gần như Gauss đạt được, đang mở rộng với sự gia tăng phân cực của chất pha loãng ( hình dưới 2).
Hình 2.Phân phối chất trong một điểm lấy mẫu sau khi bôi lên tấm TLC như là một chức năng của dung môi.
Dựa trên số lượng mẫu được phân tích, hãy chọn kích thước tấm phù hợp hoặc cắt tấm lớn hơn theo kích thước cần thiết. Đánh dấu vùng ứng dụng bằng bút chì bằng cách vẽ các đường thẳng trên tấm. Cẩn thận không làm hỏng/làm xước bề mặt lớp vì điều này có thể ảnh hưởng đến hành vi dòng chảy và dẫn đến lỗi. Cẩn thận không để mẫu quá gần cạnh đáy của tấm (8 mm từ cạnh dưới), vì điều này có thể khiến điểm bắt đầu bị giãn/rò rỉ vào pha di động. Thể tích mẫu áp dụng phụ thuộc vào mục tiêu phân tích và nồng độ của các dung dịch mẫu. Thông thường, thể tích mẫu 0,5-2,0 µL được khuyến nghị cho các kiểm tra nhận dạng và tối đa 10 µL cho kiểm tra độ tinh khiết. Thể tích mẫu càng cao thì càng dễ bay hơi và không phân cực (đối với NP) thì dung dịch pha loãng nên được thực hiện càng chậm.
Tấm làm khô trước khi phát triển
Sau khi lấy mẫu lên tấm, phải loại bỏ hoàn toàn chất pha loãng mẫu bằng cách làm khô các tấm cẩn thận trước khi phát triển. Tránh nhiễm bẩn khói trong bước này và chọn nhiệt độ thích hợp để không làm mất hoặc khuếch tán mẫu. Nhiệt độ phụ thuộc vào loại chất, độ ổn định và điểm sôi của chúng.
Điều chỉnh trước kiểm soát lớp/độ ẩm
Trừ khi các biện pháp phòng ngừa đặc biệt được thực hiện trong khi áp dụng mẫu, độ ẩm trong phòng thí nghiệm có thể làm giảm hoạt động của lớp TLC trong vòng vài phút, vì trạng thái cân bằng nhanh chóng được thiết lập giữa không khí phòng thí nghiệm và chất hấp thụ. Điều tiết trước tấm TLC trước khi phát triển sẽ giúp tránh tình trạng hư hỏng của tấm TLC. Do đó, điều tiết các tấm (sau khi lấy mẫu) trong 45 phút trên dung dịch muối bão hòa trong khoang kín. Tùy thuộc vào độ ẩm tương đối mong muốn, một số dung dịch muối bão hòa thường được khuyến nghị, ví dụ độ ẩm tương đối 33%, có thể đạt được bằng cách sử dụng dung dịch MgCl 2 bão hòa. Đảm bảo rằng vẫn còn muối chưa hòa tan trong dung dịch để đảm bảo độ bão hòa. Sau khi điều tiết, điều quan trọng là phải phát triển tấm ngay lập tức để ngăn chặn sự tái diễn của các thay đổi.
Chromatogram/Plate Development (bằng tiếng Anh)
Sự phát triển của các tấm TLC có thể được thực hiện thông qua các kỹ thuật khác nhau, ví dụ: Một chiều, hai chiều hoặc thông qua các quá trình dòng chảy cưỡng bức. Một chiều có thể là một hoặc nhiều phát triển, và được chạy theo chiều dọc, ngang hoặc tròn. Trong hầu hết các trường hợp, sự tách biệt được thực hiện theo chiều dọc trong một buồng phát triển.
Đầu tiên thêm giai đoạn di động mới được chuẩn bị trong buồng phát triển lên mức tối đa 0,5 cm (đường ngâm). Trước khi bắt đầu quá trình phát triển, cần phải có sự cân bằng giữa pha di động lỏng và pha khí để đạt được độ bão hòa buồng. Để tạo điều kiện thuận lợi cho việc này nhanh hơn, hãy thêm một miếng đệm bão hòa hoặc đặt giấy lọc bên trong khoang (thành khoang) và cân bằng trong 20 phút (giữ khoang đóng). Sau khi bão hòa buồng, đặt tấm vào trong khoang nhanh chóng. Ngay sau khi pha di động di chuyển hai phần ba kích thước tấm (tối đa 1 cm từ trên cùng), tháo tấm và đánh dấu mặt trước dung môi. Sau khi phát triển, tấm phải được sấy khô đúng cách để loại bỏ dung môi dư trước khi quan sát.
Dẫn xuất trong TLC
Sau khi tách, thông thường một dẫn xuất được thực hiện để cho phép hình dung các chất được phân tích và tăng cường phát hiện, nếu các thành phần mẫu không màu hoặc không huỳnh quang. Thuốc thử phát hiện/dẫn xuất phù hợp lý tưởng phụ thuộc vào các chất được phân tích mục tiêu và phương pháp phát hiện mong muốn. Nó có thể được áp dụng trước khi phát triển (dẫn xuất tiền sắc ký), với hệ thống dung môi (dẫn xuất tại chỗ), hoặc sau khi phát triển (dẫn xuất hậu sắc ký).
Đối với dẫn xuất sau sắc ký hoặc trực quan hóa các chất được phân tích, thuốc thử được áp dụng cho tấm bằng cách phun hoặc nhúng. Ưu điểm của phun là độ linh hoạt cao và lượng thuốc thử thấp cần thiết. Tuy nhiên, phun thủ công thường không cung cấp đủ khả năng tái tạo.
Dẫn xuất bằng cách nhúng cho phép dẫn xuất đồng nhất và tái tạo hơn nhưng đòi hỏi nhiều thuốc thử hơn. Ngoài ra, màu nền có thể xảy ra. Đảm bảo lau cẩn thận vị trí phía sau tấm sau sau khi dẫn xuất và trước khi đọc to.
Làm thế nào để đọc biển TLC?
Thực hiện TLC theo cách thích hợp sẽ cung cấp cho bạn kết quả tái tạo và chính xác cho cả phân tích định tính và định lượng.
Chúng ta sẽ đề cập đến nhiều mẹo và thủ thuật hơn cho quy trình trực quan hóa và tài liệu trong một bài viết riêng biệt.
Sản phẩm
Response not successful: Received status code 500
Tài liệu tham khảo
Để tiếp tục tìm hiểu, vui lòng đăng nhập hoặc tạo tài khoản.
Không có tài khoản?Để mang đến sự thuận tiện cho khách hàng, trang này đã được dịch bằng máy. Chúng tôi đã nỗ lực để đảm bảo việc dịch máy này cho ra bản dịch chính xác. Tuy nhiên, chất lượng dịch máy không được hoàn hảo. Nếu bạn không hài lòng với nội dung dịch bằng máy, vui lòng tham khảo phiên bản tiếng Anh.