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HPLC Discovery HS F5

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硅胶固定相
Discovery HS F5
独特的保留能力和选择性可实现更好的分离
     
键合相可提供与 C18 色谱柱截然不同的反相分离。
然而,由于 F5 色谱柱上的化合物通常 会在与 C18 相同的时间范围内洗脱出来,
使得大部分 C18 方法可轻松转换到 F5 上。
 

色谱柱具有

 
 
性质
USP 代码: L43
键合相说明: 五氟苯基丙基
封端:
颗粒组成: B型硅胶
颗粒纯度: <10 ppm 金属
颗粒形状: 球形
颗粒大小: 3, 5 and 10 µm
孔径: 120 Å
表面积: 300 m2/g
载碳量: 12 %
覆盖度: 4 µmoles/m²
pH范围(推荐值): 2 to 8

主要应用

水溶性小分子和多肽,极性化合物,碱性化合物,位置异构体

  • 与苯基固定相相比: 尽管五氟苯基丙基(F5)固定相具有芳香性,但其保留能力或选择性与苯基固定相不同。由于F5的5个氟基具有吸电子效应,因此,F5是一种强Lewis酸;F5环缺少电子,而苯基环富含电子。
 
关于将C18方法转换至Discovery HS F5柱的指导原则

通常,碱性化合物在HS F5色谱柱上的保留时间比在C18柱上更长。在C18柱上流动相中的有机相含量提高5%至10%,通常可获得与HS F5柱类似的保留值。使用其他化合物所得的结果差异则很大。然而,logPo/w值小于2.5的化合物在HS F5柱上的保留时间通常要长于C18柱。保留时间的差异程度与化合物密切相关。

如色谱图所示,与C18柱相比,Discovery HS F5柱对多官能团化合物具有更强的保留能力(表1)。在C18柱上非常接近死体积(峰1)的化合物,在Discovery HS F5柱上可被充分保留(见图2)。

 
图1. 出色的多官能团化合物保留能力
色谱柱: (A) Discovery HS F5柱和传统C18柱,(B) 15cm x 4.6mm 内径,5µm粒径
流动相:

(A) 10mM乙酸铵,0.1%甲酸;(B)甲醇

变化比例:(A) 35:65,(B) 70:30,(C) 76:24,(D) 80:20

流速: 1.5mL/min
温度: 35°C
检测: 紫外at 254nm
进样体积: 10µL
梯度表:
时间(min) %A %B
 0 90 10
 3 90 10
10 50 50
15 50 50
样品:
1.对氨基苯酚(100µg/ mL)
2.对乙酰氨基酚(10µg/ mL)
3.乙酰苯胺(10µg/ mL)
4.非那西汀(10µg/ mL)
 
 

图2. Discovery HS F5柱可高效分离C18柱不能保留的化合物
色谱柱: (A) Discovery HS F5柱和(B)传统C18柱,15cm x 4.6mm 内径,5µm粒径
流动相: 30:70, 10mM 乙酸铵 (pH 6.98): CH3CN
流速: 2.0mL/min
温度.: 35°C
检测: 光电二极管阵列
进样体积: 5µL
样品: 1. 甲卡西酮 (100µg/mL)
2. (±) 麻黄碱 (200µg/mL)

Discovery HS F5柱是一种独特的功能化反相柱,可发现奎尼丁中无法被C18保留的痕量杂质。利用C18柱在多种流动相条件下检测净奎尼丁(见图3)。条件C和D产生一个单峰,表示奎尼丁不含杂质。条件B产生的峰显示出部分分离的前肩峰。因此,使用梯度有机相快速筛选无法分离出可能存在的杂质。然而,在HS F5柱(色谱图A)上,杂质峰清晰可见。在方法开发过程中,使用Discovery HS F5柱这类独特的功能化反相柱进行快速筛选,可大大提高早期发现痕量杂质的几率,否则这些杂质可能带来潜在的巨大问题。

图4中,胞苷及相关化合物为证明HS F5柱能够比C18提供更为独特和有价值的分离提供了另一个有力证据。HS F5的另一个优势在于其在100%水溶液条件下不会发生相坍塌(phase collapse)。

 

图3. Discovery HS F5柱可分离奎尼丁中不能被C18柱分离的痕量杂质
色谱柱: (A) Discovery HS F5柱和(B)传统C18柱,15cm x 4.6mm 内径,5µm粒径
流动相: 25mM磷酸铵(pH 7.0):CH3CN。变化比例:(A) 35:65,(B) 70:30,(C) 76:24,(D) 80:20
流速: 1.0mL/min
温度.: 30°C
检测: 紫外,235nm
进样体积: 10µL
样品: 1. 奎尼丁(50µg/mL)
2. 杂质(双氢奎尼丁)

 

图4.具有独特选择性的Discovery HS F5柱对化合物的分离效果比C18柱更好
色谱柱: Discovery HS F5柱和传统C18柱,15cm x 4.6mm 内径,5µm粒径
流动相:

10mM KH2PO4,加H3PO4调整至pH 3.0(C18柱分离含5% CH3CN)

流速: 1.0mL/min
温度.: 30°C
检测: 紫外,280nm
进样体积: 10µL,每个化合物100µg/mL
样品:

1. 胞苷

2. 胞嘧啶

3.  2'-脱氧胞苷


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 LC/MS兼容性

适用于LC/MS的稳定键合相

在由独立测试实验室验证的三个调节循环之后,Discovery HS F5柱显示出具有较低的可接受流失率(1)。数据显示了从总离子色谱图(图5)的指定(阴影)区域获得的平均质谱。此外,还运行了一个空白柱,即取出安装柱并使用零死体积接头替代后,以相同条件运行内置柱。

每个质谱上的X’s代表空白柱运行和安装柱运行中发现的质量。应注意,通过与安装柱对比发现,许多主要质量均来源于空白柱。这表明,较低的可接受流失率来自于Discovery HS F5固定相。

 

图5. Discovery HS F5在LC/MS中具有低流失性
色谱柱: Discovery HS F5柱,15cm x 4.6mm内径,5µm粒径
流动相: (A) 0.1% TFA,溶剂为水,(B)甲醇。变化比例:(A) 35:65,(B) 70:30,(C) 76:24,(D) 80:20
流速: 1.0mL/min
温度.: 环境温度
检测: MS ESI (+)模式
扫描范围: m/z 100-500

 

HS F5展品低流血后3调节周期。还请注意这个测试使用的积极的流动相。

LC / MS以上结果从Shane李约瑟博士实验室主任Alturas分析,Inc .莫斯科,ID,一个独立的测试实验室。


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 可重现的色谱柱性能

持久耐用的可重现色谱柱最大限度缩短了换柱和故障排除时间

开发稳定分析方法的一个重要因素是色谱柱的重现性。色谱柱选择性应保持不变,并且蛋白质或肽类的洗脱模式必须可重现。硅胶和键合相化学的一致性确保Discovery系列具有出色的进样、色谱柱和键合相批次间重现性(见图6和7)。

图6. 重现性
色谱柱: Discovery HS F5柱,15cm x 4.6mm内径,5µm颗粒
货号: 567516-U
流动相: 55:45,10mM磷酸钾(pH 7.0):甲醇
流速: 1.0mL/min
温度: 35°C
检测: 紫外,254nm
进样体积: 5µL
样品: 如下所示(溶剂为55:45的水:甲醇)
1. 尿嘧啶(15µg/ mL)
2. 吡啶(20µg/ mL)
3. 苯酚(300µg/ mL


在pH3条件下具有良好的稳定性

图7.色谱柱使用寿命
色谱柱: Discovery HS F5柱,5cm x 4.6mm内径,3µm粒径
货号: 567504-U
流动相: 30:70,0.1%甲酸和10mM甲酸铵(pH 3.4): CH3CN
流速: 1.0mL/min
温度: 35°C
检测: 紫外,254nm
进样体积: 5µL

在pH 7条件下具有良好的稳定性

色谱柱: Discovery HS F5柱,5cm x 4.6mm内径,3µm粒
货号: 567504-U
流动相: 80:20,10 mM乙酸铵(pH 6.8): CH3CN
流速: 1.0mL/min
温度: 35°C
检测: 紫外,254nm
进样体积: 5µL

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 可扩展性

可放大至制备型分离,缩小至高速或窄径分离

所有Discovery粒径的键合相和硅胶化学一致。

如果分析型或制备型色谱柱的洗脱模式不同,则珍贵样品可能会在放大过程中浪费。

在Discovery 3或5微米粒径色谱柱上开发的分析型分离方法可完全放大为Discovery 10微米粒径和更大粒径色谱柱上的制备型分离方法。此外,在5或10微米粒径色谱柱上开发的分离方法可以缩小为3微米粒径色谱柱上的快速分析方法。

  • 大尺寸色谱柱的Discovery 10微米粒径非常适用于分离和纯化毫克至克级的化合物,以供进一步鉴定使用。
  • 小尺寸色谱柱的Discovery 3微米粒径非常适用于快速分析和LC/MS应用
图8. 使用三种粒径的Discovery HS F5柱分离普鲁卡因胺
色谱柱: Discovery HS F5柱,10cm x 4.6mm内径,3µm、5µm和10µm粒径
流动相: 65:35,25 mM磷酸铵(pH 7): CH3CN
流速: 1.0mL/min (3 & 5µm); 4.73mL/min (10µm)
温度: 30°C
检测: 紫外,280nm
进样体积: 5µL (3和5µm);23.7µL (10µm)
样品: 每个样品的浓度为50µg/mL
样品: 1. 5-氟胞嘧啶(to
2. N-乙酰普鲁卡因胺
3. 普鲁卡因胺


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应用和出版物
应用说明
T303174  #174 Improving on the USP Method: LC/MS Analysis of Paclitaxel and Related Taxanes on Discovery HS F5
 
应用报告
T003001 #01 - Analysis of Tetracycline Antibiotics on Discovery HS F5
T003030 #30 - Analysis of Amphetamines on Discovery HS F5
T003032 #32 - Analysis of Norepinephrine Metabolites on Discovery HS F5
T003033 #33 - Analysis of Norepinephrine and 3,4-dihydroxyphenyl glycol on Discovery HS F5
T003039 #39 - Analysis of Biogenic Amines on Discovery HS F5
T003040 #40 - Analysis of Selegiline and its Amphetamine Metabolites on Discovery HS F5
T003046 #46 - Drugs of Abuse on Discovery HS F5
 
Bulletins
T103938 #938 - Utility of Pentafluorophenylpropyl Stationary Phases for RP-HPLC Analyses: Biogenic Amines on Discovery HS F5
 
宣传册
T403154 Solute Attributes and Molecular Interactions Contributing to U-Shape Retention on Fluorinated HPLC Stationary Phases, David S. Bell and A. Daniel Jones, Lecture presented at Montreux 2003
T403121 Advantages of Polar Reversed-Phase Chemistries for LC/MS Analyses, David S. Bell
T402119 Unique Retention and Selectivity of Pentafluorophenyl Phases for High-Throughput LC/MS Analysis, David S. Bell, lecture presented at ASMS Conference 2002

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商标

 Discovery和Supelguard是Sigma-Aldrich公司的商标。