反相SPE方法

含水样品基质/流动相环境
基本步骤
SPE技巧

 

含水样品基质/流动相环境

与正相或离子交换SPE相比,反相SPE被认为是选择性最低的保留机制。换句话说,反相方法或键合化学可能难以区分结构相似的分子。但是,由于反相会保留大多数具有任何疏水特性的分子,因此对于提取同一样品内结构非常多样的分析物非常有用。
 
含水样品基质/流动相环境

反相SPE
保留机制: 非极性或疏水相互作用
  • 范德瓦耳斯力或分散力
示例矩阵: 含水样品
  • 生物体液(血清、血浆、尿液)
  • 组织的水提取物
  • 环境水样
  • 葡萄酒、啤酒和其他含水样品
分析物特性: 显示非极性官能团的分析物
  • 大多数有机分析物
  • 烷基、芳香族、脂环官能团
洗脱方案: 破坏与溶剂或具有充分非极性 
的溶剂混合物的反相相互作用
  • 甲醇、乙腈、二氯甲烷
  • 缓冲液/溶剂混合物
常用应用:
  • 生物体液中的药物和代谢产物
  • 水中的环境污染物
  • 组织和固体的水提取物

基本步骤

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1.样品前处理对于含有干扰物的样品(如生物体液),用缓冲液1:1稀释样品。处理可电离化合物时,pH值操作可能很重要。化合物的电离状态可以彻底改变其在给定SPE吸附剂上的保留和洗脱特性。

当一种分析物处于中性状态时,它变得更加疏水,在反相条件下保持力增强。将样品pH调节至化合物pKa以上或以下2个pH单位(取决于官能团)将有效地中和化合物。处理组织和其他固体时,用缓冲液进行固液萃取或均化。非极性溶剂(包括甲醇和异丙醇)会破坏化合物与吸附剂官能团之间的相互作用。

为避免堵塞,在将样品引入SPE相之前,可能需要离心、稀释和/或预过滤样品。

2.调节/平衡调节湿润或激活键合相以确保分析物和吸附剂官能团之间的一致相互作用。反相吸附剂通常用1-2管体积的水混溶性溶剂如甲醇或乙腈来调节。

平衡在溶剂强度和pH方面引入了类似于加样的溶液,以便最大限度地保留。1-2管体积的缓冲液(用于样品前处理)或水是反相平衡的良好选择。

3.加样以一致且下降的流速~1-2滴/秒的速度应用样品(从步骤1开始),以确保最佳的保留。

4.洗涤在加样过程中,样品干扰常常与感兴趣的化合物共同保留。洗涤步骤对于洗脱干扰物而不过早洗脱感兴趣的化合物是必要的。5-20%甲醇水溶液或样品前处理缓冲液是洗涤溶剂的典型。

5.洗脱用足够非极性的有机溶剂或溶剂组合破坏分析物和吸附剂官能团之间的疏水相互作用。例如洗脱溶剂为1-2倍体积的甲醇或乙腈。 

在处理可离子化化合物时,洗脱过程中的pH操作通常可以提高回收率。在它们的离子形式中,碱性和酸性化合物变得更具极性,减弱了反相相互作用,可能允许较弱的洗脱溶剂和/或减少的洗脱体积。

6.洗脱液后处理在LC分析前,常需在流动相中蒸发并重新配制SPE洗脱液。GC分析通常需要进一步的SPE洗脱液浓度和/或可能与更易挥发的溶剂进行基质交换。

 

SPE技巧

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1. 样品预处理过程中应破坏药物-蛋白质结合。
  • 每100µL小鼠血浆40µL 2%乙二胺四乙酸二钠
  • 每100µL小鼠血浆40µL 2%甲酸
  • 其他可能的试剂(每100μL基质):
    40µL 2%TCA,40µL 2%乙酸,40µL 2%TFA,40µL 2%磷酸,或200µL甲基纤维素(蛋白质ppt。).
2. 如果SPE洗脱液需要在分析前蒸发,洗脱后将真空空气通过SPE管大约10分钟。这将去除可能延长蒸发的残余水分。

3. 在加样和洗脱过程中维持持续缓慢的流速(每秒1-2滴)将提高回收率和重现性。

4. 减少床层重量,使洗脱体积最小化。

5. 增加床层重量以保留更多极性化合物。

6. 对吸附剂过度干燥的关注仅在甲醇调节过程中至关重要。

7. 预处理溶剂如二氯甲烷(或用于洗脱的溶剂)可在调理前使用,以去除SPE管上可能干扰后续分析的任何杂质。