这里有你不知道的去污剂小百科

 生物系统中的去污剂

去污剂是两性分子,其长亲脂性烃基(尾部)末端连有极性或带电荷的亲水基团(头部)(图1)。它们能够降低水的表面张力,因此也被称为表面活性剂

 

Hydrophobic Region

疏水区域

Hydrophilic Region

亲水区域

图1.阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)的结构,其中显示了亲水和疏水区域。

 

与纯极性或非极性分子不同,两性分子在水性介质中表现出独特的性质。它们的极性基团与水分子形成氢键,而烃链由于疏水相互作用而聚集。在低浓度下,去污剂在水中以单体形式存在,当浓度足够高时,即达到临界胶束浓度(CMC)时,单体自发形成非共价聚集物,成为胶束。在胶束中,每个去污剂分子的极性亲水区域朝向极性溶剂(水),而疏水区域形成热力学稳定的疏水核。图2为胶束简图,其解释了胶束的方向概念。真实的胶束结构更复杂、更动态,并且可能随去污剂浓度和溶液组成而变化。

图2. SDS胶束简图。

 

 去污剂如何溶解膜蛋白?

去污剂被广泛用于生物化学、细胞生物学和分子生物学研究。常见的应用包括细胞裂解、膜蛋白和脂质溶解、蛋白质结晶以及减少印迹实验的背景染色。

 

尽管研究膜蛋白是蛋白质生物化学中的一大难题,但由于膜蛋白具有显著的生物学和药理学相关性,它们依然是一个重要的研究领域。了解膜蛋白的结构和功能需要小心分离出高纯度的天然膜蛋白。由于形成胶束的去污剂提供的两性环境可模仿脂质双分子层,因此,它们成为膜蛋白功能和结构研究中必不可少的增溶剂。

 

生物膜由磷脂构成,磷脂含有两个疏水基团以及与之相连的一个极性头部。这种分子结构使磷脂能够组装成脂质双分子层,其中疏水链面向彼此,而极性头部朝向外侧的水溶液环境(图3)。蛋白质和脂质镶嵌在这个双层结构中,形成流动镶嵌模型(图4),该模型于1972年由Singer和Nicolson首次提出。脂质尾部与疏水蛋白质区域之间的疏水相互作用使蛋白质保留在脂质双分子层中。这些内在膜蛋白(IMP)(图4)不溶于水溶液,因为它们聚集在一起可保护其疏水区域;但它们可溶于去污剂,因为去污剂形成的胶束与生物膜双分子层具有相似的结构。疏水相互作用将蛋白质整合至这些胶束中。通常镶嵌在膜脂质双分子层中的膜蛋白疏水区域,现在被一层去污剂分子包围,而亲水区域暴露于水性介质中,从而使膜蛋白溶于溶液。完全去除去污剂会使膜蛋白疏水区域聚集,进而导致膜蛋白聚集和沉淀。

 

Polar Head

极性头部

Hydrophobic Tail

疏水尾部

图3.磷脂双分子层。

 

图4. 生物膜的流动镶嵌模型

 

去污剂的膜溶解过程可以分为三个阶段,其中去污剂-脂质-蛋白质比率是一个重要因素(图5

图5.去污剂溶解生物膜的三个阶段。当向生物膜中加入低浓度去污剂时(a),去污剂单体(红色线条,带单尾)分散至脂质双分子层中而扰乱膜结构(b)。当浓度等于或高于去污剂的CMC时,脂质双分子层中的去污剂分子饱和并分裂,产生脂质-蛋白质-去污剂混合胶束(c)。去污剂/蛋白质比率约为1-2(w/w)被认为足以溶解IMP,以形成脂质-蛋白质-去污剂混合胶束。去污剂浓度进一步增加会导致脂质-蛋白质-去污剂混合胶束逐渐脱脂,形成脂质/去污剂和蛋白质/去污剂混合胶束(d)。复合物中溶解的IMP与去污剂结合,产生蛋白质-去污剂复合物(PDC)。通常,去污剂/蛋白质比率约为10 (w/w)或更高时,将导致完全脱脂。

 

 去污剂的分类

1.  离子去污剂

离子去污剂含有阴离子或阳离子头部基团并具有净电荷。它们的疏水尾部是直烃链(如十二烷基硫酸钠(SDS)和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))或刚性甾体基团(如胆汁酸盐)。离子去污剂胶束的尺寸取决于侧链的疏水引力与离子基团的排斥力的综合作用。因此,通过增加反荷离子的浓度来中和头部基团的电荷,将导致胶束尺寸变大。胶束尺寸也会随烷基链长度的增加而增加。离子去污剂对于膜蛋白的溶解非常有效,但几乎都会导致一定程度的变性。

 

胆汁酸盐是一种阴离子去污剂,其主链由刚性甾体基团组成,如胆酸钠盐和脱氧胆酸钠盐。这些分子的平面结构使其具有一个极性面和一个非极性面;因此,它们的CMC较高,胶束较小,使其易于通过透析去除。胆汁酸是相对温和的去污剂,其灭活作用通常低于具有相同头部基团的直链去污剂。游离胆汁酸单体的pKa值约为5-6,并且在低pH值下具有有限的溶解度。然而,胆汁酸的缀合会降低pKa,并且会在任何给定pH下产生更大比例的离子化分子。由于胆汁酸的离子化盐形式比质子化酸形式更易溶于水,因此其缀合增强了在低pH环境中的溶解度。

 

2.  非离子去污剂

非离子去污剂含有不带电的亲水头部基团,其由聚氧乙烯部分(如BRIJR和TRITON™去污剂)或糖苷基团(如辛基葡糖苷和十二烷基麦芽糖苷)组成。由于非离子去污剂会破坏脂质-脂质和脂质-蛋白质相互作用,但不会破坏蛋白质-蛋白质相互作用,所以其被认为是非变性去污剂。正因如此,它们被广泛用于分离生物活性形式的膜蛋白。与离子去污剂不同,盐对非离子去污剂的胶束尺寸影响很小。

 

具有聚氧乙烯头部基团的去污剂可能含有化学通式为CnH2n+1(OCH2CH2)xOH的烷基聚乙烯,或位于烷基链和醚基之间的苯环。TRITON™ X-100去污剂属于后者。应注意,含芳环的去污剂在紫外区域具有光吸收,这可能会干扰在280 nm处的蛋白质分光光度监测。这些去污剂还有氢化形式可供选择,其通过还原芳环而消除紫外吸收。

 

但是,这种还原制剂中可能存在少量未反应的物质。或者,含有脂质疏水基团的市售聚氧乙烯去污剂可以取代某些应用中的芳香族聚氧乙烯。例如,在紫外不可见性比较重要的应用中,TERGITOL™ 15-S-9、TERGITOL™ TMN-10、聚氧乙烯月桂醇醚和聚乙二醇10十三烷基醚通常可替代TRITON™ X-100。这些去污剂具有脂质疏水基团,因此在紫外区域无明显光吸收。

 

尽管聚氧乙烯比合成非离子去污剂(如烷基糖苷)具有明显的成本优势,但后者仍是许多应用的首选去污剂,主要有两个原因。第一,合成非离子去污剂的成分和结构均匀。第二,含有不同烃链和极性糖基团组合的几种烷基糖苷变体易于合成为纯净物形式。烷基糖苷具有连接至葡萄糖、麦芽糖或蔗糖头部基团的各种烷基链,使其在物理化学性质方面具有微小差异,这种差异可用于膜蛋白的选择性增溶。

 

3.  两性离子去污剂

两性离子去污剂兼具离子和非离子去污剂的特点。与非离子去污剂一样,两性离子去污剂不具有净电荷,缺乏导电性和电泳迁移率,并且不与离子交换树脂结合。但是,与离子去污剂一样,它们能够有效破坏蛋白质-蛋白质相互作用。甾体类两性离子去污剂,如CHAPS,比直链两性离子去污剂(如,十二烷基二甲基二胺氧化物)的变性能力弱。

 

 去污剂选择指南

如果以100,000 x g的速度将裂解物或匀浆物离心1小时后,膜蛋白存在于上清液中,则认为膜蛋白已溶解。在大多数情况下,经过去污剂溶解后,膜蛋白的生物活性应保留在上清液中。因此,合适的去污剂应将最大数量的生物活性蛋白质保留在上清液中。目前市面上有大量的去污剂,因此,选择合适的去污剂可能非常困难。以下几点建议将有助于选择合适的去污剂。

• 查阅文献并尝试一种曾被用于分离和表征具有相似生化或酶学特性的蛋白质的去污剂。

• 应考虑去污剂在工作温度下的溶解度。例如,二甲基棕榈基氨丙磺酸盐(SB3-16)在4°C不溶于水,而TRITON™ X-114去污剂在室温下会发生相分离。

• 应考虑去污剂的去除方法。如果使用透析法,则最好使用具有高CMC的去污剂。另外,如果使用离子交换色谱法,则非离子或两性离子去污剂更合适。

• 为保留生物或酶活性,可能需要对多种去污剂进行试验。去污剂的类型和用量都会影响蛋白质活性。有些蛋白质的生物活性仅能在非常窄的去污剂浓度范围内保留。低于该浓度范围,蛋白质不溶解;而高于特定浓度,蛋白质将失活。

• 应考虑下游应用。由于TRITON™ X-100去污剂含有的芳香环可在260-280 nm吸光,因此,如果实验方案要求对蛋白质浓度进行紫外监测,则应避免使用该去污剂。同样,如果通过等电聚焦分离蛋白质,则应避免使用离子去污剂。在蛋白质凝胶电泳中,应考虑使用聚集数较小的去污剂。

• 应考虑去污剂的纯度。应使用纯度极高的去污剂,因为TRITON™ X-100等去污剂通常含有过氧化物污染物。

• 对于应避免DNA酶、RNA酶和蛋白酶等污染物的研究,有多种分子生物学级别的去污剂可供选择。

• 无毒去污剂优于有毒去污剂。例如,洋地黄苷是一种强心苷,应谨慎处理。

• 由于一些未知的原因,特定去污剂通常更适用于一些特定分离程序。例如,正十二烷基-β-D-麦芽糖苷已被发现是分离细胞色素c氧化酶的首选去污剂。因此,为确定分离生物活性膜蛋白的最佳条件,可能需要一些试错试验。

• 有时很难找到一种既适合溶解也适合分析指定蛋白质的最佳去污剂。在这种情况下,通常可以先用一种去污剂溶解蛋白质,然后改用另一种对分析干扰最小的去污剂来分析蛋白质。

• 在某些情况下,已观察到在分离缓冲液中添加含非去污磺基酸甜菜碱(NDSB)的去污剂,可显著改善膜蛋白的溶解。

 

Name Description CAS MW(g/mol) CMC Aggregation Number HLB Cloud Point (°C) Average Micellar Weight
Anionic Detergents (8)                
Alkyl Sulfates (2)                
LDS, Lithium dodecyl sulfate BioReagent, for molecular biology, suitable for electrophoresis, ≥ 98.5% (GC) 2044-56-6 272.33 8.2mM 62   >100 17,000
SDS, Sodium dodecyl sulfate ≥ 98.0% (GC), dust-free pellets 151-21-3 288.38 7-10mM 62 40 >100 18,000
Bike Acids and Salts (6)                
Cholic acid from ox or sheep bile, ≥98% (TLC) 81-25-4 408.57          
Deoxycholic acid BioXtra, ≥98% (HPLC) 83-44-3 392.57 2-6mM 3-12 16   1,200-5,000
Sodium cholate hydrate Bioreagent, suitable for cell culture, ≥99% (HPLC) 206986-87-0 430.55 9-15 mM 2-3 18   900-1,300
Sodium deoxycholate BioXtra, ≥98.0% (dry matter, NT) 302-95-4 414.55 2-6 mM 3-12 16   1,200-5,000
Sodium deoxycholate monohydrate BioUltra, ≥99.0% (NT) 145224-92-6 432.57 2-6 mM 3-12 16   1,200-5,000
Sodium taurodeoxycholate hydrate BioXtra, ≥ 97% (TLC) 207737-97-1 521.69 1-4 mM 6     3,100
Cationic Detergents (2)                
CTAB, Hexadecyltrimethylammonium bromide for molecular biology, ≥ 99% (titration) 57-09-0 364.45 0.92 mM 170 10   62,000
TTAB, Tetradecyltrimethylammonium bromide for ion pair chromatography, ≥99.0% (AT) 1119-97-7 336.39 4-5 mM 80     27,000
Non-Ionic Detergents (21)                
Brij®23 Solution, 30 % (w/v) in H2O 9002-92-0 1198.0 (avg.) 0.091 Mm 40 16.9 >100 48,000
Digitonin free of water-insoluble constituents 11024-24-1 1229.31 <0.5 mM 60     70,000
Igepal® CA-630 nonionic, non-denaturing detergent 9002-93-1 603.0 (avg.) 0.083 mM 100-155 13.4 63-67 60,300 - 93,500
Igepal® CA-720 average Mn ~735 9036-19-5 734.95 (avg.)     14.6 85-90  
MEGA-8, N-Octanoyl-N-methylglucamine ≥97% (GC) 85316-98-9 321.41 79 mM        
MEGA-9, N-Nonanoyl-N-methylglucamine ≥98% (GC) 85261-19-4 335.44 25 mM        
MEGA-10, N-Decanoyl-N-methylglucamine ≥ 98% (GC) 85261-20-7 349.46 6-7 mM        
n-Dodecyl β-D-maltoside BioXtra, ≥ 98% (GC) 69227-93-6 510.62 0.17 mM 78-149     40,000-76,000
n-Octyl-b-D-Glucopyranoside ≥98% (HPLC), 50 % (w/v) solution in H2O 29836-26-8 292.37 18-20 mM 27-100   ≥100 7,900-29,200
Nonidet™ P40 Substitute BioXtra, mixture of 15 homologues 9016-45-9 680 (avg.) 0.059 mM 132 13.5 45-50 90,000
Pluronic® F-68 10%, sterile-filtered solution, BioReagent, suitable for insect cell culture 9003-11-6 8400 (avg.) 17.9 mM   >24 >100  
Polysorbate 20 tested according to Ph.Eur. 9005-64-5 1228 (avg.) 0.059   16.7 76  
Polysorbate 80 tested according to Ph.Eur. 9005-65-6 1310 (avg.) 0.012 mM 58 15 65 79,000
Saponin for molecular biology, used as non-ionic surfactant, adjuvant 8047-15-2 1000-2000 0.001-0.01%        
Span®60 45 - 55 % (GC) 1338-41-6 430.63     4.7    
TERGITOL™ MIN FOAM 1x 68551-14-4 640 34 ppm   12.6 40  
TRITON™ X-100 BioUltra, for molecular biology, ~10% in H2O 9002-93-1 647.0 (avg.) 0.23 mM 75-165 13.5 66 80,000
TRITON™ X-100 reduced Hydrogenated to reduce UV absorbance 92046-34-9 564.8 0.2-0.9 mM 100-155 13.5 65 80,000
TWEEN® 20 meets EP testing specification 9005-64-5 1228 (avg.) 0.059 mM   16.7 76 *
TWEEN® 40 viscous liquid 9005-66-7 1284 (avg.) 0.027 mM   15.6    
TWEEN® 80 for molecular biology, syrup 9005-65-6 1310 (avg.) 0.012 mM 58 15 65 79,000
Zwitterionic Detergents (4)                
CHAPS 100 mM solution 75621-03-3 614.88 8 mM 10   >100 6,150
CHAPS hydrate ≥ 98% (TLC) 331717-45-4 614.88 8 mM 10   >100 6,150
SB3-12, Lauryl sulfobetaine used for protein solubilization 14933-08-5 335.55 2.8 mM (20 mM Tris-HCl, pH 8.0,0.1 M NaCl) 55 - 87     18,500 - 29,100
SB3-14, Myristyl sulfobetaine ≥ 99% (TLC), BioXtra 14933-09-6 363.6 0.16 mM 83 - 130     30200 - 47,300