抗体

采用蛋白A、蛋白G或蛋白L琼脂糖进行抗体纯化

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本实验方案是从是从哺乳动物血清、腹水和细胞培养上清液中快速纯化抗体的方法。需要注意的是,如果起始材料为血清或腹水,则最终的制备物中含有内源性宿主IgG及特异性抗体。总之,存在的此种内源性IgG不应干扰抗体实验。此 (193 Kb PDF)中列出了来自于多个物种和单克隆抗体来源的正常血清的免疫球蛋白内容。

注意:Sigma® 提供了采用蛋白A纯化抗体的PURE1A 试剂盒。

纯化实验方案
试剂和设备
操作步骤

纯化实验方案(1 ml纯化柱)

注意:本实验方案采用高摩尔浓度、高pH的蛋白A上样缓冲液,以增强蛋白A与弱亲和力亚型抗体(如小鼠IgG1)的结合能力。蛋白G和L的结合在中性pH下进行,因此采用磷酸盐缓冲液作为上样缓冲液。结合的Ig的洗脱在柠檬酸缓冲液、pH条件下一步完成,可以去除所有与树脂结合的亚型。不同物种来源IgG的蛋白A和蛋白G结合容量可通过此 (71 Kb PDF)预估出来。1-2 pluse的IgG亚型的结合容量为1-5 mg IgG/ ml树脂。3-4 pluse的IgG亚型的结合容量为10-25 mg IgG/ ml树脂。蛋白L可以结合所有Ig亚型,对4 pluse物种的结合容量为3-10 mg IgG/ ml树脂。建议所用树脂至少含有2个待纯化物种的材料Ig 亚型的pluse。

 

试剂和设备

1.      血清、附属或细胞培养上清液

2.      蛋白A上样缓冲液:1 M磷酸钾,pH 9.0

3.      蛋白G或L上样缓冲液:0.01M 磷酸盐缓冲液(PBS),pH 7.4(货号 P4417

4.      洗脱液:0.1 M柠檬酸,pH 3.0

5.      1.5 M Tris碱,用于中和洗脱液

6.      3 - 5 ml 加样针(柱式针筒) ,玻璃纤维

7.      旋塞,Luer-Lock(货号S7396

8.      环形垫片,夹钳

9.      试管,管架

10.    光度计,比色皿

11.    pH 计

12.    移液管,吸球式

13.    搅拌器,搅拌棒和搅拌板(用于缓冲液制备)

14.    无菌过滤装置(可选)

15.    叠氮化钠(防腐剂)(货号S2002

 

操作步骤

1.      制备缓冲液。缓冲液可在4 °C下储存1-2周。通过无菌过滤装置过滤可延长缓冲液的保存期,但并不强制要求这么做。

2.      制备纯化柱管。取下注射器柱塞并丢弃。将少量玻璃纤维压入注射器底部,至足够形成约1/2 - 1 cm厚的衬垫。装上柱塞。用1-2 ml上样缓冲液冲洗。确保玻璃纤维衬垫牢牢停留在注射针筒底部。

3.      倒置旋转反应瓶,在2 ml上样缓冲液中重悬树脂。避免过度振荡,请勿涡旋悬浆。

4.      将悬浆倒入注射针筒。等待过量的缓冲液排出,然后采用5 ml上样缓冲液洗涤纯化柱。请勿让树脂晾到全干。

5.      如有可能,预估上样到血清、腹水或上清液中的Ig量。如果Ig量未知,此 (193 Kb PDF) 包含不同物种血清、小鼠腹水及细胞培养上清液中的大致Ig水平,可用于预估起始材料的Ig量。根据起始材料物种Ig的树脂结合容量(参见下注)以及起始材料中的Ig量,计算要上样的体积。

注:上述为大致数值,仅用作初步指导。流体中及结合到树脂上的实际Ig浓度会有所变化,必须通过实验确定起始材料和树脂的比例。
 

6.      采用3倍体积的上样缓冲液稀释血清或腹水。采用1倍体积的上样缓冲液稀释上清液。

7.      将稀释后的材料涂到纯化柱上。将未结合的组分收集到试管或烧杯中,保存以便后续处理。每ml树脂采用5 ml上样缓冲液洗涤未结合的蛋白。

8.      将洗脱液涂到纯化柱上。收集1/2柱体积的组分。每ml树脂采用10 ml洗脱液。

9.      每ml树脂采用5 ml上样缓冲液平衡。检查流出物pH,确保纯化柱已调节至上样缓冲液pH。

10.    检测280 nm处的蛋白洗脱液组分。(如有必要,可采用总蛋白测定试剂盒进行目视测定。)

11.    汇集蛋白阳性组分。采用1.5 M Tris碱中和至pH 6 – 8。

12.    如有必要,可将未结合的组分重新涂到柱上,以便回收第一次过滤未结合的任何Ig(如果上样的材料量超过柱容量时会出现这种现象)。

13.    透析进所需的缓冲液,即4 °C、pH 7的PBS。透析液的体积应至少为蛋白溶液的20倍。在至少每2-4小时内,应至少更换2次透析液,以确保透析液充分平衡。

14.  如果不再进行反应,则采用含有0.05 - 0.1%叠氮化钠的PBS洗涤纯化柱。采用柱塞或保鲜膜密封纯化柱,在4 °C下储存。

注意:如有需要,可采用梯度成型设备(例如,货号G6897)为0.1 M柠檬酸盐缓冲液创造pH 6.5 至 pH 3.0的线性pH梯度,,从而从蛋白A中分离小鼠和人IgH亚型。总的梯度体积应至少为柱体积的10倍。这种洗脱方法的劣势是,产生多个必须要中和和测试的峰值,且所得的产物稀释度远远超过单洗脱步骤。

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