抗体

ELISA操作步骤

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 间接ELISA

试剂和仪器

1.     磷酸盐缓冲盐(PBS)片剂:10mM磷酸盐缓冲液,pH 7.4,150mM NaCl(货号P4417)和0.1%叠氮化钠(货号S2002)。

2.     碳酸盐-碳酸氢盐缓冲胶囊,pH9.6(货号C3041)。

3.     洗涤液(PBS-T):10mM磷酸盐缓冲液,pH7.4,150mM NaCl,0.05%Tween 20(货号P3563

4.     单克隆一抗

5.     对照抗体:物种和同种型匹配的非特异性免疫球蛋白(例如作为小鼠单克隆一抗对照的小鼠骨髓瘤蛋白)

6.     碱性磷酸酶标记的二抗或过氧化物酶标记的二抗

7.     碱性磷酸酶标记的二抗(例如SIGMAFAST TM pNPP片剂,货号 N1891)的底物,或者过氧化物酶标记的二抗(诸如SIGMAFAST TM OPD片剂,货号P9187)的底物。

8.     碱性磷酸酶终止试剂:3 M NaOH(可选)或过氧化物酶终止试剂:3M HCl或3M H2SO4(可选)

9.     微量滴定板

10.   配备有405nm或450/492nm滤光片(分别用于pNPP或OPD)的酶标仪。

操作步骤

抗原包被

1.     采用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液或PBS中制备适当浓度的抗原溶液。

2.     微量滴定板的每个孔中加入0.2ml上述溶液。

3.    37°C孵育30分钟,或4°C孵育过夜(需完全覆盖)。

4.     去除包被液,用PBS-T洗涤三次。

注意:如果发生非特异性结合的问题,可能需要额外的封闭步骤(5%BSA-PBS,30分钟)。 欲了解更多信息,请参阅:Vogt, R.F., et al., J. Immunol. Meth., 101, 43 (1987).

一抗反应

1.     用PBS-T稀释单克隆一抗。最佳浓度应使用滴定法来确定。

2.     每孔加入0.2ml稀释的单克隆抗体。阴性对照应该是在PBS-T中稀释的物种和同种型匹配的非特异性免疫球蛋白。

3.     室温孵育2小时。

4.     洗涤步骤同抗原包被的步骤4。

二抗结合

1.     用PBS-T稀释酶结合的二抗。每孔加入0.2ml该溶液。最佳浓度应使用滴定法来确定。

2.     室温孵育2小时。

3.     洗涤步骤同抗原包被的步骤4。

底物制备

1.     在使用之前,最后一次孵育期间,准备酶底物或将预制底物液置于室温。

显色

1.     每孔加入0.2ml新鲜制备的底物。

2.     30分钟后,阳性孔中应显色(pNPP或OPD分别为黄色或橙色)

3.     可以直接在酶标仪(405nm或450nm,分别用于pNPP或OPD)中读取吸光度,或者可以用合适的终止试剂(每孔50μl)停止反应,以后读取吸光度(405nm 或492nm,分别用于pNPP或OPD)

 

 捕获ELISA

捕获ELISA(也称为“三明治”ELISA)是一种灵敏的方法,可用来定量许多皮克到微克级别的物质(如激素,细胞信号化学物质,传染病抗原和细胞因子)。几个原因使得需要这种类型的ELISA而不是直接或间接ELISA:待分析的物质可能太稀而不能与聚苯乙烯微量滴定板结合(如细胞培养上清中的蛋白质),或与塑料结合不佳(如小的有机分子),可能混合了太多的其他物质以至于不能很好的与平板结合。描述及利用捕获ELISA的两个Sigma试剂盒是TNF-α试剂盒和小鼠分型试剂试剂盒(货号ISO2)。


试剂和仪器

1.     磷酸盐缓冲盐(PBS):10mM磷酸盐缓冲液,pH 7.4,150mM NaCl片剂(货号P4417)和0.1%叠氮化钠(货号S2002)

2.       碳酸盐-碳酸氢盐缓冲胶囊,pH9.6(货号C3041)

3.    洗涤液(PBS-T):10mM磷酸盐缓冲液pH7.4,150mM NaCl,0.05%Tween 20(货号P3563)

4.     捕获或包被抗体

5.     用于标准曲线的对照抗原

6.     标记的检测抗体

7.    底物。通常使用最敏感的底物(例如使用过氧化物酶作为酶标记时,则为TMB或OPD)。

8.     终止液(可选)

9.    微量滴定板

10.   酶标仪

操作步骤

注意:提供的步骤为通用的方法。捕获抗体、样品、对照和检测抗体的最佳稀释度以及孵育时间需要凭经验确定,可能需要大量的滴定实验。理想情况下,可以使用本方案中所描述的酶标记的检测抗体。但是,如果检测抗体未标记,则二抗不能与包被抗体或样本发生交叉反应。也应包括合适的阴性和阳性对照。

捕获抗体的包被

1.     在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液或PBS中适当稀释捕获或包被抗体。捕获抗体通常以0.2至10μg/ ml铺板。 优先选用使用亲和纯化的抗体或至少IgG部分使用亲和纯化。

2.     按每孔0.2ml将稀释的捕获抗体加入到微量滴定板的每个孔中。

3.     37°C孵育1小时(需完全覆盖)。

4.     去除包被液。用洗涤缓冲液(PBS-T)洗涤平板3次。

对照和样品的结合

1.     将0.2ml适当稀释的样品和对照加入相应的孔中。通常,样品在PBS中以10ng-10μg/孔的范围稀释(测定越敏感,需要的样品越少)。

2.     室温孵育平板1小时。

3.     去除样品或对照溶液。用洗涤缓冲液(PBS-T)洗涤平板3次。

检测抗体的结合

1.     稀释酶标记的检测抗体。

2.     每孔加入0.2ml适当稀释的检测抗体。

3.     室温孵育平板30分钟。

4.     去除检测抗体溶液。用洗涤缓冲液(PBS-T)洗涤平板3次。

5.     加入合适的底物溶液。

6.     让平板显色(通常30分钟)并添加终止溶液(可选)。

7.     在酶标仪上以适当的波长读取吸光度。

 

参考文献

1.     Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, (New York,1988), p. 579 (Product No. A2926)

2.     Coligan, J.E. et al. (Eds), Current Protocols in Immunology. John Wiley & Sons, (New York, 1991), 2.1.10.

3.     Crowther, J.R., Methods in Molecular Biology, Volume 42: ELISA, Theory and Practice, Humana Press, (New Jersey, 1995)

4.     Desphande, S.S., Enzyme Immunoassays: From Concept to Product Development, Chapman & Hall, (New York, 1996) (Product No. Z370258)

5.     Diamandis, E.P. and Christopoulos, T.K. (Eds.), Immunoassay, Academic Press, (New York, 1996) (Product No. Z373672)

6.     Ferencik, M., Handbook of Immunochemistry, Chapman & Hall, (New York, 1993), p. 346-356

7.     P. Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Practice and Theory of Enzyme Immunoassay, Elsevier Science Publishers, (Amsterdam, The Netherlands, 1985)