抗体

荧光原位杂交(FISH)

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试剂和设备 
操作步骤 
参考文献

 

试剂和设备

1.      20x生理盐水 - 柠檬酸钠缓冲液(SSC:3 M NaCl,0.3 M柠檬酸钠,pH7或货号S6639)。

2.      溶于2x SSC的100 µg/ml RNase A(货号R4642)。

3.      溶于10 mM HCl的胃蛋白酶浓度(货号P6887),40 units/ml。

4.      多聚甲醛,EM级(货号P6148)鲜配,4% w/v水溶液。

5.      乙醇

6.      标记探针。用生物素-11-dUTP通过切口翻译随机引物结合或聚合酶链式反应(例如ADVANCE TM Nick Translation Kit)标记质粒DNA。

 

7.      杂交混合溶液:溶于2×SSC 的50%甲酰胺(货号F7508),10%硫酸葡聚糖(货号D8906),0.1%SDS(货号L4390),0.5-1.5 ng/µl标记探针和300 ng/ml鲑鱼精子DNA(货号D7656)。

8.      洗涤液:溶于0.1x SSC的20%甲酰胺(货号F7508)。

9.      检测液:溶于4×SSC 的0.2% Tween 20(货号P1379)。

10.    封闭液:溶于检测液的5%牛血清白蛋白(货号A3803)。

11.    封闭液中的抗体或检测化合物(例如抗生蛋白链菌素-Cy3,货号S6402)。

12.    2 µg/ml抗淬灭封固剂DAPI(货号D9542)。

13.    荧光显微镜、滤光片和可选的三重带通滤光片(x58,Omega Optics)。

14.    玻璃载玻片(货号S8400)。

15.    用于孵育和杂交步骤的塑料盖玻片(从耐高压加热的废袋中切割,例如货号B4408)。

16.    加热模块/改进的热循环仪。

17.    用于清洗步骤的Coplin罐(货号S6016S5641S5891)。

 

步骤

载玻片制备  

杂交

检测

载玻片制备

1.  首先选取任意细胞类型的染色体制剂。

2.  用200 µl RNA酶在37℃孵育1小时。

3.  在2x SSC中洗玻片5分钟,重复一遍。

4.   用10 mM HCl冲洗载玻片。

5.   用200 µl胃蛋白酶于37℃孵育10分钟。

6.   用去离子水冲洗载玻片。

7.   在2x SSC中洗玻片5分钟,重复一遍。

8.   在多聚甲醛中固定载玻片10分钟。

9.    在2x SSC中洗玻片5分钟,重复一遍。

10.  乙醇梯度脱水载玻片:70%、80%、95%;每个浓度2分钟。

11.  风干

杂交

1.     每张玻片准备30 µl杂交溶液。加热至70°C维持10分钟,置于冰上。

2.     在每块载玻片上放置30 µl杂交溶液,盖上塑料盖玻片。

3.     加热模块在65-70°C变性5分钟。

4.     逐渐降温至37°C。

5.     在湿度大的房间中37℃杂交过夜。

检测

1.     取出盖玻片用2×SSC清洗玻片。

2.     在40°C洗涤缓冲液中洗5分钟,重复一遍。

3.     用0.1×SSC在40℃洗涤载玻片5-15分钟。

4.     用2x SSC在40°C洗片5-15分钟。

5.     将玻片冷却至室温。

6.     在检测缓冲液中平衡载玻片5分钟。

7.     在封闭缓冲液中封闭20-30分钟。

8.     与50 µl抗体或检测化合物(例如含5 µg/ml链霉抗生物素蛋白-cy3的封闭缓冲液)一起孵育30-60分钟。

9.     用2x SSC清洗载玻片5分钟,重复两次。

10.   用DAPI复染10分钟。

11.   快速冲洗并置于抗淬灭封固剂中。

12.   用荧光显微镜分析。

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