抗体

细胞免疫荧光标记

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试剂和设备

操作步骤

荧光染料性质 (49 Kb PDF)

参考文献

抗体是证明抗原存在和对其进行亚细胞定位的重要工具。细胞染色是一种非常多功能的技术。如果抗原被高度定位,则细胞染色可在细胞中检测到少至1000个抗原分子。在一些情况下,细胞染色也可用于通过图像分析仪等工具确定抗原的近似浓度。细胞染色可分为四个步骤:细胞制备、固定、抗体结合和评估。

第一步,将待染色的细胞附着到固相载体上,以便于后续过程的处理。这可以通过几种方法来实现:可以在显微镜载玻片、盖玻片或光学上合适的塑料载体上培养贴壁细胞。可以将悬浮细胞离心到载玻片上,使用化学连接物结合到固相载体上,或者(某些情况下)在悬浮液中处理。

第二步是固定和透化细胞,确保抗体能够接触抗原。完美的固定可以固定抗原,同时保持真实的细胞和亚细胞结构,并使抗体能够不受阻碍地进入所有细胞和亚细胞区室。通常使用宽范围的固定剂,方法的正确选择取决于被检抗原的性质和所用抗体的特性。固定方法一般分为两类:有机溶剂和交联剂。有机溶剂(如醇类和丙酮)可去除脂质并使细胞脱水,同时沉淀细胞结构蛋白。交联剂(如多聚甲醛)通常通过游离氨基形成分子间桥,从而形成连接抗原的网络。交联剂能比有机溶剂更好地保存细胞结构,但是可能会降低一些细胞组分的抗原性,并且需要添加透化步骤才可允许抗体进入样品。两种方法的固定都可能使蛋白抗原变性,因此,针对变性蛋白制备的抗体可能更适用于细胞染色。本文描述了四种不同的固定方法。应根据相关应用选择适当的固定方法。

细胞染色的第三步涉及用抗体孵育细胞制剂。通过洗涤去除未结合的抗体,直接检测结合的抗体(如果标记的是一抗),或使用荧光染料标记的二级试剂间接检测。(见荧光染料性质)(49 Kb PDF)

在第四步也是最后一步中,使用荧光显微镜评估染色。

 

试剂和设备

1.    在盖玻片上培养的细胞

2.    PBS:0.01M磷酸盐缓冲盐水,pH 7.2-7.4(P3813P4417

3.     

a.   甲醇,在-20℃下冷却至少1小时(货号32213)

b.   丙酮,在-20℃下冷却至少1小时(货号24201)

或者

c.   3-4%多聚甲醛(货号P6148)的PBS溶液。用5N NaOH并温和加热而溶解在PBS中

d.   0.5% Triton X-100(货号T9284)的PBS溶液

或者

e.   3-4%多聚甲醛(货号P6148)的PBS溶液。用5N NaOH并温和加热而溶解在PBS中

f.    甲醇,在-20℃冷却至少1小时(货号32213

或者

g.   PEM缓冲液:0.1M PIPES(货号P8203),5 mM EGTA(货号E4378),2 mM MgCl2·6H2O(货号M0250)。用NaOH溶液将pH调至6.8

h.   乙醇,在-20℃冷却至少1小时(货号270741

4.    一抗

5.    抗体对照

6.    荧光染料标记的二抗

7.    水性封固剂

8.    显微镜载玻片(76 x 25 mm,货号S8902

9.    荧光显微镜,配备适当的荧光检测过滤器

10.  倒置光学显微镜(例如Nikon TMS)

 

操作步骤

细胞制备

固定

一抗结合

二抗结合

评估

注意事项:

1.    作为通用实验方案提供。一抗和二抗的最佳稀释度、细胞制剂、对照以及孵育时间需要根据经验确定,可能需要大滴定量。理想情况下,可以使用产品数据表中推荐的一抗。还应包括适当的阴性对照和阳性对照。

2.    请参阅相应的SDS安全处理所需的化学品。

3.    对荧光偶联物和标记载玻片遮光保护。在黑暗中孵育样本,并尽可能遮盖。

 

细胞制备

1.   从培养箱中取出细胞。在倒置光学显微镜下检查以确认所需的外观。弃去培养基。

2.    用PBS冲洗;去除多余的溶液。

 

固定

1.    固定细胞:

描述了四种不同的固定方法。根据应用(或产品数据表推荐)选择合适的固定方法。

甲醇-丙酮固定

a.   在-20℃下,在冷却的甲醇中固定10分钟。

b.   去除多余的甲醇。

c.   在-20℃下,用冷却的丙酮透化1分钟。

或者

多聚甲醛-Triton固定

d.   用3-4%多聚甲醛固定10-20分钟。

e.   用PBS短暂冲洗。

f.    用0.5% Triton X-100透化2-10分钟。

或者

多聚甲醛-甲醇固定

g.   用3-4%多聚甲醛固定10-20分钟。

h.   用PBS短暂冲洗。

i.    在-20℃下,用冷却的甲醇透化5-10分钟。

或者

PEM-乙醇固定

j.     在PEM缓冲液中固定10分钟。

k.   用PBS短暂冲洗两次。

l.     在-20℃下,用冷却的乙醇透化5-10分钟。

2.    用PBS清洗三次(每次至少5分钟)。

 

一抗结合

1.    将一抗在PBS中稀释到适当的稀释度。在细胞上盖上盖子,在室温下孵育60分钟(建议使用加湿室)。

2.    用PBS清洗三次(每次至少5分钟)。

 

二抗结合

注意:二抗只适用于间接测定。

1.    将标记的二抗在PBS中稀释到适当的稀释度。涂覆在盖玻片上并在室温下孵育30分钟。

2.    用PBS清洗三次(每次至少5分钟)。

3.    去除多余的PBS。

 

评估

1.    用封固剂封固盖玻片并翻转到载玻片上。

2.    在显微镜下检查。

3.    记录结果。建议拍摄标记的细胞。

注意:建议进行适当的阴性对照。阴性对照产生一抗和二抗的背景荧光和非特异性染色。理想的阴性对照试剂是荧光染料缀合的小鼠单克隆或骨髓瘤蛋白。它应该是同种型匹配的,对被研究物种的细胞没有特异性,并且与测试抗体具有相同的浓度。自发荧光或阴性对照试剂荧光的程度将随所研究细胞的类型和所用仪器的灵敏度而变化。对于具有Fc受体的细胞的荧光分析,必须使用同种型匹配的阴性对照。

 

参考文献

1.    Giloh H. and Sedat, J.W. Fluorescence microscopy: Reduced photobleaching of rhodamine and fluorescein protein conjugates by n-propyl gallate. Science, 217, 1252-1255 (1982).

2.    Storz, H. and Jelke, E., Photomicrography of weakly fluorescent objects-employment of p-phenylenediamine as a blocker of fading. Acta Histochem., 75, 133-139 (1984).

3.    Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (New York, 1988). (Product No. A2926)

4.    Johnson, G.D. et al., Fading of immunofluorescence during microscopy: A study of the phenomenon and its remedy. J. Immunol. Methods, 55, 231-242 (1982).

5.    Longin A., et al., Comparison of anti-fading agents used in fluorescence microscopy: image analysis and laser confocal microscopy study. J. Histochem. Cytochem, 41(12), 1833-1840 (1993).

6.    Beesley, J.E. (ed.) Immunocytochemistry: A Practical Approach, IRL Press (1993), p. 215, p. 216.

7.    Bullock, G.R. and Petrusz, P. (eds.) Techniques in Immunocytochemistry, Volumes 1, 2, 3 and 4, Academic Press (1982, 1983, 1985, 1989). See Volume 1, p. 186.