Prestige抗体

人类蛋白质图谱

人类蛋白质图谱(HPA)计划工作流程

自2003年以来,人类蛋白质图谱(HPA)计划一直在通过基于抗体的蛋白质组学来探索人类蛋白质组,将抗体的高通量制备与标准组织和细胞微阵列中的蛋白质谱分析相结合。这一探索分三个阶段完成:1)抗体制备,2)应用特异性验证,3)蛋白质表达谱分析。

抗体制备

 
使用专门研发的抗原设计软件,每个抗体的生产开始于蛋白质抗原决定簇特征标签(PrEST)的选择。PrEST片段的长度通常为50-150个氨基酸,并且尽可能的与其他蛋白质不相似。采取特别措施避免跨膜区域、信号肽以及与其他人类蛋白质的高度区域和/或序列相似性。通过一系列质量保证步骤来测试重组的PrEST抗原。对质粒插入片段进行测序,并使用质谱分析所得重组蛋白的大小,以确保制备并纯化正确的抗原。之后,将重组PrEST蛋白用作免疫抗原。

抗体的亲和纯化过程经历三步:1)通过耗损步骤除去标签特异性抗体,2)利用PrEST特异性过滤柱收集抗原特异性抗体,3)脱盐和缓冲液置换以达到抗体长期储存的最佳环境。为了确保抗原特异性,纯化的抗体在用384个随机选择的PrEST蛋白质片段组成的蛋白质阵列上进行测试。

应用特异性验证

HPA研发的每种抗体都经过验证可用于免疫组织化学(IHC)。每种抗体都做了以下分析:

  • 48个正常人组织,三次重复
  • 20个最常见的肿瘤组织
  • 46个细胞系
  • 12种临床细胞类型

生成超过700幅IHC图像,每个图像都由经过认证的病理学家或受过专门教育的研究人员进行注释和管理。此外,抗体还经过免疫印迹(WB)分析和免疫荧光(IF)显微镜检测。

免疫印迹分析使用标准设置样本,由五种不同的人蛋白质裂解物(细胞系RT-4和U-251MG,血浆,肝脏和扁桃体组织)组成,并使用标准实验方案进行。此外,某些抗体使用过表达裂解物进行免疫印迹分析。

对于免疫荧光显微镜检测实验,每种抗体都采用三种人类细胞系分析。实验结果通过不同通道的细胞器探针直观展示。和IHC一样,所有的IF图像都是用亚细胞位置、染色强度和染色特征的信息手动注释。

蛋白质表达谱

一旦抗体验证完成,每个应用将根据生物信息学预测和文献资料的一致性进行验证评分。另外,通过比较不同应用中的相似性,针对相同靶标的不同抗体被进一步标注。这些显示相似染色模式的抗体更加强化了它们的可靠性。所有的图像和数据都可在人类蛋白质图谱网站www.proteinatlas.org公开获取。