癌症研究

流式细胞术

Sigma-Aldrich将客户研究需求放在第一位,专注于癌症研究的分析技术和实验方案。我们将全程推出不同的癌症研究工具,为您提供最新的技术和产品。

 


流式细胞术在癌症研究中的应用
流式细胞术使研究人员能够测量悬浮细胞的几种物理特性,如细胞形状、大小和内部复杂性。通过使用荧光化合物来检测特定的细胞成分,并进一步分析该成分。例如,与健康的二倍体细胞相比,肿瘤细胞通常具有异常量的DNA(非整倍体,即染色体过多或过少)。这是流式细胞术在癌症研究领域的核心应用。

 


以下功能测定摘自书目《Cancer Cell Culture: Methods and Protocols》(©2004 Humana Press, Product No. Z701424)。此方法是本书中的几种详细的分析方法之一。该书还包含癌细胞系分离和培养的详细方案。

 

 

“流式细胞术分析人类癌细胞系DNA”

作者:Peter Mullen

From Methods in Molecular Medicine, vol. 88 Cancer Cell Culture: Methods and Protocols, pp. 248-255
S. P. Langon, Editor
Humana Press Inc., Totowa NJ, Copyright 2004

材料

2.1 制备溶液

  1. 柠檬酸盐储存缓冲液:
    在含有去离子水和50 mL二甲基亚砜(DMSO, D2650)的烧杯中加入85.5 g蔗糖(S7903, 250 mM)和11.76 g柠檬酸三钠·2H2O( C5920, 40 mM)。调整pH至 7.6,补充去离子水至1 L并置于4°C保存。该缓冲液用于分析前储存冷冻样本。
  2. 原液:
    在2 L去离子水中加入2 g柠檬酸三钠二水合物(C5920, 3.4 mM)、2 ml Igepal® CA-630(CA-630, I3021, 0.1% v/v)、1044 mg精胺四氢氯化物 (S2876, 1.5 mM))和121 mg Sigma 7-9(T1378, 0.5 mM),调节pH至7.6。该“原液”用作消化/染色缓冲液。.2
  3. 溶液 A:
    在500 ml原液中加入15 mg胰蛋白酶(T0303)(调节pH至7.6)。
  4. 溶液 B:
    在500 ml原液中加入250 mg胰蛋白酶抑制剂(T9253)和50 mg RNase A (R4875)(调节pH至7.6)。
  5. 溶液 C:
    在500 ml原液中加入208 mg碘化丙锭(81845)和580 mg精胺四盐酸盐(S1141),调节pH至7.6。在整个制备、储存和染色过程中均使用金属箔保护溶液免受光照(参见 注 2)。
  6. 所有溶液等分为20 ml试样于-70℃储存。

2.2 细胞培养

  1. 选择目标细胞系,例如MCR-7乳腺癌3或PE01卵巢癌4 细胞。
  2. RPMI/PS/10% FCS:在500 ml RPMI 1640培养基(R8758)中加入5 ml青霉素/链霉素(PS, P4333),终浓度分别为100 U/ml和100 µg/ml。加入55 ml (10%)胎牛血清F6178(参见 注3)。
  3. 杜氏磷酸缓冲盐(PBS),D8662
  4. 1X胰蛋白酶-EDTA,T3924
  5. 75-cm2和150-cm2组织培养瓶(Corning® 塑料制品)
  6. 10 ml进样针和21G针头
  7. FACS管

2.3 制备DNA分析样品

  1. 水浴和涡旋混合器,Z258415
  2. RNase, R4875

2.4 采集流式细胞术DNA直方图

  1. FACSCalibur™流式细胞仪(Becton Dickinson)(参见 注4

2.5 分析流式细胞术DNA直方图

  1.  细胞周期分析软件,例如ModFit LT™ (Verity Software House)

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方法

3.1 细胞培养

  1. 在25 ml RPMI/PS/10% FCS中悬浮0.5×10 6 MCF-7乳腺癌或PE01卵巢癌细胞并转移至75-cm2 组织培养瓶中。置于37℃、5%CO2的湿润培养箱中。
  2. 等待细胞生长至融合,每周补充营养物两次(先吸出旧的培养基,用20 ml PBS洗涤细胞,然后加入25 ml新的组织培养基)。
  3. 细胞融合时,除去旧的组织培养基并用10 ml PBS洗涤细胞。除去多余的PBS。
  4. 向每个培养瓶中加入5 ml胰蛋白酶/ EDTA并放回培养箱中直至细胞分离(参见 注 5)。
  5. 使用无菌移液管将细胞悬液转移至无菌通用容器中;倒入20 ml RPMI / PS / 10%FCS(使胰蛋白酶失活)于培养瓶中冲洗,然后将冲洗液与通用容器中的细胞悬浮液(总体积25 ml)混合。
  6. 600 g离心5分钟。
  7. 倒掉培养基,并用5 ml RPMI / PS / 10%FCS重悬沉淀。使用21号进样针破碎沉淀三次,然后补充RPMI / PS / 10%FCS至25 ml。
  8. 使用血细胞计数器计数细胞总数。
  9. 将1×10 6个细胞的等分试样转移至FACS管(容量不限),再600 g离心5分钟。
  10. 用100 µl 柠檬酸盐缓冲液重悬沉淀,遮盖试管,并于分析前储存在-40°C下。

3.2 制备分析样品

  1. 制备和染色用于DNA分析的细胞核之前,在37°水浴中复苏溶液A和B以及冷冻全细胞悬液(100 µl)(但不加热),。将溶液C于室温下复苏,然后置在冰上。
  2. 加入450 µl 0.003%胰蛋白酶溶液(溶液A),将细胞悬浮液消化至细胞核,混合并在室温下放置10分钟(参见注67)。
  3. 加入0.05% (w/v)胰蛋白酶抑制剂溶液和0.01% (w/v) RNase A(溶液B)至终体积为375 µl,停止消化,混合均匀并静置10分钟。
  4. 最后,加入416 µl/ml冰冷碘化丙锭/ 1.16 mg/ml精胺四氢氯化物溶液(溶液C)至终体积为250 µl,染色细胞,并于分析前将样品置于暗处静置10分钟。

3.3 采集流式细胞术DNA直方图

  1. 本实验方案假定用户熟悉流式细胞术原理和操作,并能够按照所用仪器随附的操作手册运行样品。
  2. 为收集数据,所有绘图必须格式化为“采集”。
  3. 绘制前向散射 (FLS)与侧向散射 (SS)的双参数点图。
  4. 用线性x轴绘制单参数FL2(面积)直方图显示相对DNA含量(碘化丙啶荧光通常位于FL2通道;参见注8)。
  5. 绘制FL2(面积)与FL2(宽度)的双参数点图,以监测双峰值(参见子标题3.4)。
  6. 选择FL2信号阈值(信号为阳性结果的点),然后设置一个适当的值来限制碎片(第一个值20足够)。
  7. 由于仅有一种荧光色素(碘化丙啶),因此无需补偿。
  8. 放置样品并将仪器设为“运行”。 使用合适的设置面板,调整FLS和SS光电倍增管(PMT)电压,使第一个双参数点图(FLS与SS)中的大部分点大致分布于方框的中心。
  9. 上调或下调FL2光电倍增管电压,直到峰出现在图中。然后可微调电压,使主峰位于线性图中沿x轴的方向约四分之一处。此电压将为G2 / M峰(含有两倍于单个细胞的DNA)的x轴留出足够的空间而不会溢出末端。此直方图也可监测可能出现的四倍体细胞。
  10. 设置仪器后,收集了10000个非限制事件。数据文件存储于合适的文件夹中,以便后续使用细胞周期软件进行检索/分析。

3.4 分析流式细胞术DNA直方图

  1. 数据临时分析可以采用类似于数据采集的方式进行,所有直方图格式化为“分析”而非“采集”。
  2. 绘制FL2(面积)与FL2(宽度)的双参数点图,打开第一个数据文件,并设置FL2(面积)与FL2(宽度)内大部分细胞周围的“门”点图。定义为“门1”。
  3. 用线性x轴绘制单参数FL2(面积)直方图来表示相对DNA含量。通过取消选择默认的“非门”结果来格式化直方图,并选择“门1”。
  4. 根据您的仪器以恰当的方式在第一个(G0/G1),中间(S)和第二个(G2/M)细胞群周围放置光标,并选择适宜的统计方法。成功的分析应该显示在细胞周期的G0/G1期,S期和G2/M期的细胞比例。
  5. 准确分析细胞周期必须使用仪器附带的专用软件。用户应熟悉此类软件以及用于此类分析的合适的统计模型。本实验方案使用FACSCalibur流式细胞仪提供的ModFit软件进行分析。
  6. 打开ModFit程序并选择相应的FILE
  7. 选择分析参数;此处选择Fl2A分析相对DNA含量。
  8. 通过选择FL2A(x)和FL2W(y)来定义“gate 1”。拖动门(R1)的每个点以覆盖整个目标细胞群。
  9. 选择特定的MODEL来分析数据或根据指定的参数使用推荐的模型,例如样品是新鲜或冷冻或石蜡包埋;DNA含量是二倍体,非整倍体或四倍体;是否含有多聚体; 或可见的G2/M比例。若按照内参,该模型也可说明内参存在。
  10. 检查自动放置在直方图上的标记的位置和RANGE,并根据需要调整它们的位置(尤其是S期比例相对较高时)。
  11. 使用FIT选项计算相对细胞周期分布。对其他样本重复上述过程,确保目标细胞群位于定义的“门”内。必要时调整门。
  12. 然后可将数据列表并导出为合适的演示文档,例如Excel。

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注解

  1. 许多癌细胞系不是真正的二倍体,而是非整倍体,非整倍体的定义是比DNA指数1.0有大于10%的偏差。除了正常的二倍体状态之外,许多初代肿瘤可以形成一种或多种非整倍体细胞系。构建的癌细胞系通常表现出单一的二倍体或非整倍体细胞群。
  2. 碘化丙啶是一种DNA嵌入剂,因此操作必须小心且丢弃方式须谨慎。
  3. 胎牛血清(FCS)在使用前必须在56℃水浴中加热30分钟进行热灭活。然后等分成60 ml试样并储存于-20℃下。
  4. 尽管本实验方案主要涉及特定的仪器,即Becton Dickinson FACSCalibur,但该方法也适用于其他仪器。但直方图和细胞周期分析软件设置方式可能不同。
  5. 细胞脱离培养瓶的时间间隔取决于所使用的细胞系,通常约为5-10分钟。
  6. 在胰蛋白酶消化之前,可以将鸡红细胞核(CEN)和鳟鱼红细胞核(TEN)添加到样品中用作内参,以计算倍性(所讨论的细胞系的二倍体DNA含量5。由于CEN和TEN细胞的总DNA比人类细胞少(分别为35%和80%),假定人类二倍体指数1.0,它们的DNA指数定义为0.35和0.8。CEN或TEN峰的相对位置(通道数)可用于确定未知样品的相对DNA指数。尽管在确定已知细胞系的倍性值时都可以包括内参,但由于TEN的G2 / M峰位于正常二倍体细胞的S期比例。若需要做倍性检查的同时采集细胞周期数据,则可以使用CEN。
  7.  关于CEN和TEN对照是否为最合适的内参仍存在争议。若所讨论的细胞系本质上不是真正的二倍体(在此种情况下,由于它们的相对DNA含量相同,两个峰会产生重叠),人类血液制剂(倍性值为1.0)可能更具相关性。
  8. 所有单参数直方图在1024通道(而非256)时分辨率最高。

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参考文献

  1. Vindeløv, L.L., Christensen, I. J., Keiding, N., Spang-Thomsen, M., and Nissen, N. I. (1983) Long term storage of samples for flow cytometric DNA analysis. Cytometry 3, 317-322.
  2. Vindeløv, L.L., Christensen, I. J., Nissen, N. I. (1983) A detergent-trypsin method for the preparation of nuclei for flow cytometric DNA analysis. Cytometry 3, 323-327.
  3. Soule, H. D., Vazquez, J., Long, A. Albert, S., and Brennan, M. T. (1973) A human cell line from a pleural effusion derived from a breast carcinoma. J. Nat. Cancer Inst. 51, 1409-1413.
  4. Langdon, S. P., Lawrie, S. S., Hay, F. G., et al. (1988) Characterisation and properties of nine human ovarian cancer cell lines. Cancer Res. 48, 6166-6172.
  5. Vindeløv, L.L., Christensen, I. J., Nissen, N. I. (1983) Standardisation of high-resolution flow cytometric DNA analysis by the simultaneous use of chicken and rout red blood cells as internal reference standards. Cytometry 3, 328-331.

Igepal是GAF Corporation的注册商标。
FACSCalibur是Becton Dickinson的商标。
ModFit LT是Verity Software House, Inc的商标。

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