抗体

免疫沉淀

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试剂和设备

过程

参考文献

故障排除指南 (27 Kb PDF)

免疫沉淀(IP)是最广为使用的免疫化学技术之一。免疫沉淀加上后续的SDS-PAGE和免疫印迹,是各种应用中的常规流程。这些应用包括测定蛋白抗原的分子量,研究蛋白互作,测定特定酶活性,监控蛋白质翻译后修饰和确定蛋白质是否存在及存在数量。IP技术还被用于检测稀有蛋白。稀有蛋白通常很难被检验到,而免疫沉淀法能将它的浓度提高10000倍。

在免疫沉淀法中,来源于细胞和组织匀浆的蛋白质在合适的裂解缓冲液中,通过形成含有抗原(蛋白),一抗和蛋白 A-, G-, 或L-琼脂糖偶联物或者二抗-琼脂糖偶联物的免疫复合物的方式沉淀。琼脂糖偶联物的选择取决于物种来源和一抗的同种型。描述的方法具有可比性,方法的选择取决于特定的抗原抗体体系。

试剂和设备

1.   琼脂糖偶联物:蛋白质A固定在 Sepharose® CL-4B (货号P3391)或者蛋白G-琼脂糖4B(货号P3296)或蛋白L-琼脂糖(货号P3351)或抗体-琼脂糖偶联物(二抗偶联物选择依据物种来源和一抗同种型)

2.    细胞或组织裂解准备液

3.    免疫沉淀一抗(参考产品特异性)和无关抗体(阴性对照)

4.    SDS-PAGE和免疫印迹试剂和仪器(参见免疫印迹试剂和设备

5.    HNTG缓冲液:20 mM HEPES缓冲液pH7.5(货号H4034),含有150 mM NaCl(货号S9625), 0.1% (w/v)Triton X-100(货号X100)和 10% (w/v)甘油(货号G9012

6.    洗涤液(冰上冷却):HNTG缓冲液,或 PBS pH 7.4(货号P4417),或其他缓冲液(RIPA缓冲液,依据需要的洗涤严格程度选择。

7.    Laemmli样品缓冲液(提供1X,2X(货号S3401)或3X)含有或者不含有 2-巯基乙醇(2-ME(货号M7154))

8.    微量离心管(货号T9661

9.    微离心机(货号C3361)和摇床

 

操作步骤

特异性抗原免疫沉淀

方法A 

方法B 

SDS-PAGE准备

特异性抗原免疫沉淀

注:如无特别标明,免疫沉淀IP步骤中所有离心管需放冰上保存

1.    用洗涤液冲洗琼脂糖偶联物2次,12,000xg室温离心10 s,弃上清。
注:如果琼脂糖偶联物是粉末,用去离子水复溶,让它膨胀5分钟。

2.    用洗涤液复溶琼脂糖偶联物(50%悬浮液)。

3.    继续根据需要选择方法A或者B。

方法A

4.   在每一管中加入50-100 µl适度稀释后的抗体(稀释度参考抗体特异性)。

5.    在每一管中加入 10 µl 适度稀释后的抗体(稀释度参考抗体特异性)。

6.    室温孵育15-60 min,在合适的摇床上温和混匀样品。

7.    4 °C下3,000xg离心2 min。弃上清。

8.    每个样本用1ml洗涤液冲洗,4 °C下3,000xg离心2 min。重复这一步至少2次。

9.    在每一管中加入0.1-1.0 ml细胞裂解产物。

10.   4°C 孵育,时间从90min到过夜不等。在合适的摇床上温和混匀样品。

11.   离心收集免疫沉淀复合物,4 °C下3,000xg离心2 min。弃上清。

12.   用1ml洗涤液冲洗沉淀,4 °C下3,000xg离心2 min。重复该步骤至少3次。

方法B

4.    加入细胞裂解产物 (0.1-1.0 ml),10 µl适当稀释抗体(稀释度参考抗体特异性)。

5.    4°C 孵育,时间从90min到过夜不等。在合适的摇床上温和混匀样品。

6.    加入50-100 µl琼脂糖偶联物悬浮液(约25-50 µl琼脂糖/柱床体积)

7.    4°C 孵育15-60 min。在合适的摇床上温和混匀样品。

8.   离心收集免疫沉淀复合物,4 °C下3,000xg离心2 min。弃上清。

9.    用1ml洗涤液复溶沉淀,4 °C下3,000xg离心2 min。重复该步骤至少3次。

SDS-PAGE准备

1.    用25-100 µl Laemmli样本缓冲液重悬沉淀,终浓度为 1x样品缓冲液。95 °C加热样品5 min。

2.    12,000xg室温离心30 s。收集上清(IP样品)。如果需要(并且蛋白质稳定性允许)IP样品可以-70 °C保存在样品缓冲液中。

3.    已知浓度样本和MW标准SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶合适的百分比浓度需要参考蛋白质分子大小)。

4.    转移到硝化纤维,进行免疫印迹操作(查看免疫印迹操作步骤)。

参考文献

1.    Harlow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor. Laboratory Press (New York, 1988), p. 469. (Product No. A2926)

 

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