检测

Ampliflu™ Red

Sigma-Aldrich®现提供基于荧光的酶底物Ampliflu Red(货号90101)。这是用于特异、灵敏检测HRP标记抗体的可靠新工具。其可为成熟的化学发光抗体免疫检测方法提供可行的替代方案,并具有低背景信号的优势。根据现有实验室设备,Ampliflu Red可在具有相应设置或类似成像系统的激光扫描仪上进行检测。在进入检测步骤之前,可以使用标准的抗体孵育方案。与大多数化学发光应用一样,其孵育时间为5分钟,但不必进行信号积累,只需进行简单的荧光读数。

Ampliflu Red通过HRP标记的二抗转化为高度荧光的试卤灵。 通过激发孵育后的膜(例如使用激光扫描仪)并使用发射滤光片(λex= 571nm /λem= 585nm)进行成像。 Ampliflu Red方法的检测极限约为1 ng / 条带,不需要像化学发光一样额外的信号累积时间。

 

Figure 1. Schematic overview for the use of Ampliflu Red Image

 

图1.使用Ampliflu Red的示意图。SDS-PAGE和免疫印迹转印后,目标蛋白被固定在膜上,随后经一级抗体靶向,再与携带辣根过氧化物酶(HRP)标记二级抗体进行孵育。Ampliflu Red通过HRP的作用转化为试卤灵。成像可以通过激发试卤灵(λex= 571nm /λem= 585nm)和荧光成像来完成。

 

免疫印迹检测

为了获得最佳的信噪比,我们强烈建议使用低荧光PVDF膜进行免疫印迹转印并用5%BSA封闭。使用Ampliflu Red时,可在进入检测步骤之前,使用标准的抗体孵育方法。将抗体处理和洗涤的膜与Ampliflu Red和溶于PBS的H2O2的混合物孵育5分钟,然后可以通过激光激发和发射滤光片完成成像。这一过程不需要像化学发光一样额外的信号累积时间。Ampliflu Red适用于每条蛋白条带中蛋白含量在1ng至1μg之间。


图2给出的例子显示了通过抗-FLAG抗体,HRP标记的二抗和Ampliflu Red方法在ImmobilonTM -FL PVDF-膜上进行免疫印迹转印后检测到FLAG-BAP蛋白。在具有532nm激发和580nm发射滤光片的FLA-3000(富士)激光扫描仪上进行成像,生成具有低背景的图像。具有准确匹配的激发源和发射滤波器设置的其他成像系统也可能得到类似的结果。

Figure 2. Detection of FLAG-BAP Protein Image

图2. 在4-20%SDS-PAGE上分离FLAG-BAP蛋白(50ng-1ng),并通过免疫印迹转印到低荧光PVDF膜上,用溶于PBS中的5%BSA进行封闭,先后再与ANTI-FLAG® 一抗(1:1000),兔抗小鼠IgG-HRP二抗(1:10000)进行孵育,最后通过Ampliflu Red显影。在具有532nm激发和580nm发射滤光片的FLA-3000(富士)激光扫描仪上完成成像。

 

Figure 3. Ampliflu Red Protocol Image

 

图3. SDS-PAGE和免疫印迹转印后使用Ampliflu Red的操作步骤。对于小量膜,封闭和洗涤步骤在50ml体系中完成,而抗体孵育在25ml体系中完成。溶于PBS的Ampliflu Red孵育混合液(2ml)包含:20μl Ampliflu Red(在DMSO中制备10mM的储存液)和100μl H2O2 (在H2O中制备20mM的储存液)。PBST缓冲液中含有0.1%Tween-20。

 

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79454 Ampliflu Red 免疫印迹试剂盒
92001 Ampliflu Red "“易用”试剂盒

 

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